浅析PCR技术及其在食品微生物检测中的应用

2021-03-30许竞思

现代食品 2021年19期

◎ 许竞思

（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350000）

随着人们对生活质量要求的提高，食品安全问题在人们心中的关注度不断提升，这在一定程度上促进了我国食品安全检查部门在工作上的调整与发展。采用更加先进的技术进行食品安全检测，能够进一步保证食品质量，确保消费者能够购买到放心的食品。相对于其他微生物检测技术，PCR检测技术依靠其高精准性和高效率等特点脱颖而出，在一定程度上给食品检测部门的食品微生物检测工作带来了巨大便利。通过该技术的应用，能够在更短的时间内检测出食品中的致病菌情况，例如某地出现食物中毒群体事件，通过PCR检测技术快速检出食物中的病原微生物种类，及时为患者的救治提供方向；并且PCR检测技术能够通过实验的方式推断出食品在生产后阶段内微生物的繁殖速度与最大繁殖量，能够在具有预见性的基础上对食品安全进行有效检查。

1 PCR技术及其在食品微生物检测中的作用

1.1 PCR技术原理

PCR技术应用于食品微生物检测的原理可简要概括为：经高温变形、低温退火及中温延伸等3步不同环节反复操作，从而检测微生物的核酸序列，通过利用单个核酸分子序列完成复制，达到扩增的目的。具体分析PCR技术的应用原理，需根据温度不同整合信息，即高温变形[1]。被检测食品微生物处于双链状态的DNA序列于温度高达94 ℃状况下变性，成功解链，以双链形式存在，低温退火。55 ℃下，被检测微生物特异性引物与处于单链状态的DNA进行融合，中温延伸。72 ℃下，需以被检测微生物引物的引导延伸为条件进行复制，检测微生物的DNA序列。以上所述3点，PCR的应用需反复操作，直至获取足量被检测微生物的DNA序列，以达到PCR技术检测要求。

1.2 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是食品进行微生物检测中的主要技术手段，其主要依靠的是荧光传递技术对微生物基因进行标记，并通过记录不同时间内被标记DNA的数量，检测微生物的繁殖能力。在该技术的具体实施中，主要是依赖受体发色团之间的偶极—负极之间的相互影响与相互联系实现的，并结合能量进行转移的方式进行检测，供体发色基因-受体发色基因会表现出不同强度的荧光，并且荧光的强度与DNA的产生数量呈正比关系[2]。所以在进行实际检测的过程中，可以将该技术应用其中，通过记录靶序列初始浓度，检测反应过程中荧光实际浓度来得到所需要的检测结果。在该检测技术的实际应用中，能够对食品中所含有的微生物进行基因标记和基因复制，即使食品中含有的微生物数量较少，同样可以通过标记与记录初始浓度的方式进行食品微生物检测。该检测方式具有自动化高，操作简单、准确性高等特点，适用于我国当前的食品环境市场。因此，该检测技术在实际检测中得到诸多应用，有着极高的发展与普及速度。

2 PCR技术在实际应用中的测定方法

PCR技术在食品检测中有着十分出众的表现，并且应用范围广泛。例如，在食品检测中最常见的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等，都能够通过PCR检测方式进行有效检测。以金黄色葡萄球菌为例，其在水果、蔬菜中繁殖速度很快，如果水果、蔬菜存放时间较久，则果蔬的表面很容易繁殖大量的金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌的代谢产物肠毒素对人体的损伤很大，严重的情况下会导致食用者出现食物中毒情况。因此，在对食品检查的过程中，就需要对类似菌进行科学检查，排除其给人体造成的威胁隐患。本文所研究的PCR技术，就能够对被检测食物样品中的相关物质及微量元素进行检测，并且检测精准度极高，食品生产企业采用该技术进行出厂检验，能够有效避免这些不合格的食品流入市场[3]。在具体检测中，其主要的检测手段是对特定蛋白进行标记，并且通过对蛋白的检测，间接获得被检测微生物的含量。PCR技术在食品微生物检测中的应用十分广泛，能够针对不同被检测菌展开有效检测，提高检测的准确性。

2.1 常规PCR检测法

常规PCR检测法是进行食品微生物检测中最常用的检测手段，其主要是针对测定目标物质的DNA模板和与其反应的引物进行混合。在检测的过程中，在混合后的混合物内加入一定量的聚合酶就能够制作成最基本的检测样本。在后期的检测中，还需要在特定的温度与反应条件下进行培养反应。在适合的温度下，添加了聚合酶的混合物会在聚合酶的作用下促使目标物质进行基于电脑模板序列下的扩增，在经过多个周期后，模板DNA片段可以不断地复制与扩增。在实际检测工作开展中，测定物上特定DNA能够反映出被检测食物在特定时间内会产生的物生物种类与数量。常规的检测手段主要是利用了DNA的复制能力与扩增能力，将潜在的、少量的微生物群形成可观的微生物群，实现基本的食品微生物检测。

2.2 多重PCR检测法

多重PCR检测法是基于常规检测方法上进行改变与创新形成的检测方法。常规检测方法采用的是单引物的方式进行检测，而多重PCR检测手段则是采用多个DNA引物进行检测。例如，在同一个PCR反应体系内，需要加入两个或两个以上的反应引物，这些反应引物同样需要在聚合酶的作用下进行复制与扩增。由于在反应前加入了多个DNA引物，再通过聚合酶反应后，能够得到多个不同的DNA反应片段。因此，多重PCR检测方式能够针对微生物的多个致病因子进行分析与测定，可以大幅度提高检测的准确率与效率。相比较常规PCR检测法而言，其所分析出的致病因子更多，可以避免检测过程中出现被检测菌遗漏的情况，是提高检测严谨性的有效方法。因此，在当前食品微生物检测中，除了对具有针对性的致病菌进行检测以外，大多数情况下会采用多重PCR检测法进行食品微生物检测，能够在最大程度上降低检测内容遗漏的情况发生，有效缩短了检测时间，提高了检测的准确率。并且该检测法能够减少样本的投入量，在一定程度上还具有较高的经济效益，在检测过程中可以直接对多个基因进行检测。

2.3 PR-PCR检测法

PR-PCR检测是PCR检测法的一种变形，其与常规检测法存在一定的区别，但是在食品微生物检测工作中却具有一定的优势。该方法的检测原理主要是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用01igo（dT）或随机引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。该检测法与常规检测法的区别在于将检测目标中的一条RNA先进行逆转录得到与之互补的DNA，并以此目标为基础进行后期的复制和扩增。在该技术实施中，需要重点注意的是所逆转录的DNA模板必须是完整的，并且不含有蛋白质或者是其他杂质，这条基因链必须完整。在后期的微生物检测工作开展中，可以用于微生物检测的定量分析，如将荧光技术与数字技术结合的PCR检测，通过将所测定目标中的微生物进行定量的方式进行相关检测，能够确保检测过程具有较高的灵敏性，检测结果更加准确。在实际食品微生物检测工作开展中，运用PR-PCR检测法，能够具有针对性地检测微生物，可以确保检测结果的精准度更高。

3 PCR技术在食品微生物检测中的应用

PCR技术目前已经广泛应用到食物、水源的检测中，其在微生物检测中占有重要的地位。

3.1 用于食品致病菌的检测

传统的食品微生物检测手段十分落后，不仅检测过程烦琐，而且检测的准确率难以得到保障。在传统的检测手段下进行食品微生物检测，需要对被检测的微生物进行富集培养，当其数量在样品中达到可检测水平后才能够进行微生物分离，并对微生物的形态特征等进行鉴定。该种检测模式不仅需要人工培养微生物，在培养的过程中还容易出现各种突发情况，导致所培养的微生物并不能够用于检测。但相比之下，PCR检测方式就有着较大的突破，PCR检测方式能够针对细菌中的编码rRNA进行扩增和复制，通过扩增方式得到所需要的DNA片段，并通过片段检测的方式，能够高效便捷地获得致病菌的存在情况[4]。另外，PCR检测方式还能够将人工无法培养的或培养效果较差的微生物，采用扩增的方式获取DNA片段，弥补传统检测手段中的诸多不足。

3.2 用于生活饮用水中指示细菌的检测

水质是影响人们健康的又一重要影响因素，除了食物安全以外，水质的检测同样十分重要。水质的检测是以检测大肠杆菌和人类粪便中污染的大肠杆菌为检测指标。传统的检测方法烦琐，需花费几天的时间。若根据大肠杆菌能够利用β-半乳糖苷酶，采用明确的底物进行检测，则可以更加迅速地检测到大肠杆菌。然而有一些大肠杆菌品系并不表达β-葡萄糖醛酸苷酶，因此偶尔也会出现检测失败[5]。而PCR技术为检测β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一个更加灵敏和特异性更强的方法，并且在检测的过程中还能够通过扩增的方式对多种大肠杆菌的类型进行检测，可以在更短的时间内完成更高质量的检测。

3.3 用于乳酸菌的检测与鉴定

以双歧杆菌为例，P.KAUFMANN等人比较了双歧杆菌现有的32个种及相关种的16S rRNA基因序列后，发现在其1 412～1 432位的寡核苷酸碱基序列（21个）在所有的双歧杆菌中相同，能作为双歧杆菌属特异的寡核苷酸片断，可用其作为PCR的引物来扩增双歧杆菌16S rRNA的基因片断。而模板DNA通过简单的SDS裂解菌体细胞，而后用蛋白酶K去除蛋白即可获得。在此条件下，所有的双歧杆菌可由PCR扩增产生典型的1.35 kb的核苷酸片断，而其他细菌则不产生此带，故以此作为检测基础，实现对乳酸菌种类及数量的检测与鉴定。