抗冻蛋白研究现状及其在食品工业中的应用

2021-03-30赵明明

现代食品 2021年16期

◎ 赵明明

（山东省食品药品审评认证中心，山东济南 250014）

随着研究的逐步深入，人们对抗冻蛋白的结构、分类、特性及作用机理等方面进行了阐述。不同来源的抗冻蛋白具有不同的特性，为此，本文综述了抗冻蛋白的来源、提纯及其在食品工业的应用，为寻找抗冻蛋白的新来源，实现工业化生产提供参考。

1 抗冻蛋白的来源

目前，抗冻蛋白的研究已涉及多类生物，从研究对象分析，抗冻蛋白主要来源于鱼类、昆虫、植物[1]。鱼类中的抗冻蛋白研究比较透彻，并已经将其基因转入植物体内来降低植物冻害；昆虫中抗冻蛋白的抗冻活性是鱼类的10倍～100倍；植物中的抗冻蛋白具有显著抑制冰晶形态的作用，但对植物中抗冻蛋白的研究较晚，依据相对较少。本文将从鱼类、昆虫、植物3大类来源进行简述。

1.1 鱼类中的抗冻蛋白

自20世纪60年代DEVRIES从比目鱼血清中发现抗冻蛋白以来，不断有科学家从其他极地鱼类和冷水鱼中发现抗冻蛋白[2]。抗冻蛋白主要来自于极地鱼类和冷水鱼类的血清和上皮组织中，鱼类血清是从鱼类获取抗冻蛋白的主要来源。科学家们已从南极大头鳗鲡、太平洋鲱鱼等的血清中提取到不同类型的抗冻蛋白。根据已有研究[3]，目前从鱼类中发现的抗冻蛋白主要有5大类，分别是抗冻糖蛋白、抗冻蛋白I、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ和抗冻蛋白Ⅳ。

1.2 昆虫中的抗冻蛋白

伴随着鱼类血清中不断发现新的抗冻蛋白，研究者试图从耐寒的昆虫血淋巴中提取抗冻蛋白。1968年GRIMSAY首次证实黄粉甲幼虫血淋巴中存在高活性的抗冻蛋白。之后又有学者不断从不同昆虫血淋巴中提取出抗冻蛋白。MOK YEE-FOONG从马里恩岛的17种节肢动物包括螨、蜘蛛、弹尾目、啮虫目及鞘翅目等的血清中分离到不同类型的抗冻蛋白。昆虫血淋巴是探索分离新的昆虫抗冻蛋白最常用的途径之一，且在昆虫中发现的抗冻蛋白多存在于越冬的昆虫体内。目前，对以下4种昆虫抗冻蛋白的研究最为广泛，即黄粉虫、美洲脊胸长椿、枞色卷蛾和甲虫[4]。TOMALTY HEATHER E等已经开发了一种从实验室饲养的冷驯化甲虫幼虫中产业化提取抗冻蛋白的方法。

1.3 植物中的抗冻蛋白

自1992年加拿大的GRIFFITH第1次明确提出获得植物内源性抗冻蛋白以来，目前已研究了60多种植物体中抗冻蛋白的存在性，并在多种植物体中发现了抗冻蛋白[5]，如野生香蕉、沙冬青、冬油菜等。抗冻蛋白多存在于耐寒植物体中，在不同组织均有发现。在不同生物体或同一生物体的不同组织中抗冻蛋白的存在和活性是不一样的。目前，对植物抗冻蛋白的研究虽然有所进展，但对植物体内具体抗冻蛋白的理化特性、类型及具体的作用机制还不太清楚。下一步，从不同植物体内提取内源性抗冻蛋白，并对其类型、结构进行分析是研究的重点。

2 抗冻蛋白的分离纯化方法

分离纯化出抗冻蛋白是确定抗冻蛋白来源，进一步工业化生产抗冻蛋白的前提。目前，人们已在鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌体内发现了多种抗冻蛋白，部分已采用基因工程，将提取出的抗冻蛋白基因进行表达，导入生物体内组织培养，进而实现产业化生产。现对抗冻蛋白分离纯化常用方法进行阐述。

2.1 传统的分离纯化方法

传统的分离纯化方法主要根据蛋白质分子量、所带电荷、等电点和亲水性等性质的差异进行分离。常用的技术有离子交换层析、凝胶层析、等电聚焦、疏水层析及高效液相色谱等方法，在实际操作中一般将几种技术联合使用。

其一般步骤以DEBORAH J. SIMPSON等[6]分离抗冻蛋白为例，取35 g树皮在液氮下捣碎→加热煮沸15 min→纱布过滤，在4 ℃、20 000 g、离心15 min获上清→通过探索确定Q-sepharose层析的缓冲液pH=7→洗脱并收集有活性的成分→4 ℃对磷酸缓冲液（pH=7）透析过夜→透析液上羟基磷灰石柱子，1 M磷酸缓冲液（pH=7）、1 mL·min-1洗脱→收集有活性成分，超滤浓缩→上Superdex75，50 mmol Tris-hcl（pH=7），1 mL·min-1洗脱→收集有活性成分SDS-PAGE分析为单一蛋白。

通过分析发现，植物中的抗冻蛋白一般具有热稳定性，可以根据这一特性在抗冻蛋白分离过程中加入热处理，以除去杂质蛋白，利于后续纯化。传统分离方法存在分离周期长、过程复杂、收率低、分离过程不稳定及重现性差等缺点。

2.2 冰吸附法分离纯化抗冻蛋白

抗冻蛋白具有吸附到冰晶表面并修饰冰晶形态的特性，科学家尝试利用碎冰来提取抗冻蛋白。2003年KUIPER设计一套冰手指装置，通过降温吸附蛋白，成功纯化出抗冻蛋白Ⅲ。2010年，CAI等[7]把碎冰加入到女贞叶粗提液中直接冰提抗冻蛋白，并探讨了冰提时间和用冰量对抗冻蛋白提取的影响，最终获得了4种抗冻蛋白。冰特异性吸附分离法利用抗冻蛋白对冰的特殊吸附，一步分离后可显著提高抗冻蛋白的纯化倍数，比传统的色谱法更快、更有效。但这种方法需对纯化过程进行严格控制，且分离装置较为复杂。随着目前蛋白质纯化设备的发展和改进，该方法具有广阔的应用前景。

2.3 SDS-PAGE分离纯化抗冻蛋白

HON等[8]采用单一的SDS-PAGE法从冬小麦中获得7个主要的抗冻蛋白多肽，其中的5个分子量为19、26、32、34及36的多肽显示出高抗冻活性。其操作步骤为：冬小麦预处理→95 ℃处理5 min→上12%的SDS-PAGE→电泳跑完后将胶压碎，用50 mmol Tris-HCL（pH=8）和0.1%SDS洗提多次→进行离心去除胶，得上清→加入4倍上清体积的预冷乙醇处理→得沉淀溶解与10 μL的0.1 M NH4HCO3，获得0.6 mg抗冻蛋白。这一方法是已知文献中获得抗冻蛋白最简便的方法。

3 抗冻蛋白在食品中的应用

抗冻蛋白因其安全且能有效抑制冰晶重结晶的能力，在食品的冷冻冷藏中具有广泛的应用前景，能有效抑制冰晶生长，减少营养成分的损失，保证食品品质。

目前，已有学者成功将抗冻蛋白应用到冷冻猪肉、冷冻面团、冰淇淋及果蔬保鲜中。冰淇淋是食品工业领域中抗冻蛋白应用最为成功的案例。ZHANG等[9]向冰淇淋中加入0.1%抗冻蛋白，提高了冰淇淋的再结晶性和耐熔化性。此外，0.1%抗冻蛋白的加入使冰淇淋的玻璃化转变温度由-29.14 ℃提高到-27.74 ℃。