噬菌体的跨黏膜转位以及噬菌体对机体免疫影响的研究进展

刘燕坤，林 焱，朱伟云

(国家动物消化道营养国际联合研究中心，江苏省消化道营养与动物健康重点实验室， 南京农业大学消化道微生物研究室，南京 210095)

噬菌体是一类可特异性感染细菌、霉形体、螺旋体、放线菌的病毒，广泛存在于环境和生物体中，根据感染后细菌宿主的不同结果，噬菌体可分为烈性噬菌体和温和性噬菌体(也称为溶原性噬菌体)。其中，烈性噬菌体自其发现之初就因其可直接裂解杀死宿主菌的特性而被当作天然的抗菌剂来控制细菌感染性疾病，这种方法又被称为噬菌体疗法。而后因抗生素的发现以及噬菌体自身的局限性，有关噬菌体疗法的研究几乎停滞。近年来，随着细菌的耐药性越来越严重，这一古老但仍处于起步阶段的方法又重新受到重视。作为一种具有广泛应用前景的抗菌剂，目前，噬菌体的研究主要集中于针对人及动物的耐药菌感染性疾病(如致病性大肠杆菌感染[1]、铜绿假单胞菌感染[2]、金黄色葡萄球菌感染[3]、鲍曼不动杆菌感染[4])和环境中特定病原菌的消毒(如医院环境中致病菌[5]、坚硬物体表面生物被膜[6-8]和食品中食源性病原菌的清除[8-9])，并且均已取得不错的效果。

人体微生物群落在黏膜器官分布最多，特别是在肠道。肠道是人和动物体中微生物种类和含量最为丰富的部位，对于肠道细菌菌群对机体健康的重要作用成为近二十年研究的热点，并取得一些重要进展，包括微生物-肠-脑轴和微生物-肠-肝轴的发现[10]。噬菌体的生存繁殖依赖于宿主菌，理论上讲，有细菌的地方即有噬菌体存在。随着测序技术的发展，肠道病毒组在肠道生态中的作用逐渐受到关注，肠道病毒的宏基因组学研究表明，肠道病毒中的绝大部分是噬菌体，且已被证实与肠道细菌菌群紧密相关，其可通过裂解活动和水平基因转移等来调控肠道内菌群组成和代谢特性，进而影响下游菌群代谢产物的组成及水平。

虽然噬菌体治疗机体细菌感染效果十分显著，但目前对肠道噬菌体的研究多集中于对肠道菌群和肠道健康的影响，噬菌体本身对机体免疫系统影响的研究尚不够深入，对噬菌体跨肠黏膜转位进入机体后对机体健康和免疫系统影响的研究同样较少。因此，本文对目前已有的针对噬菌体对于真核细胞乃至机体整体免疫功能影响的研究进行综述，为今后更广泛深入地研究提供参考。

1 噬菌体黏附于黏膜并发挥抗菌作用

机体的黏膜分布于消化道、呼吸道、生殖道等多个器官中。黏膜表面暴露于外环境中，执行物质交换功能的同时也会与大量微生物接触，但黏膜的屏障作用可保护机体抵抗外环境中的病原入侵。黏膜表面的黏液层是构成黏膜物理屏障的重要组成部分之一，同时，黏液层还可为共生微生物的定殖提供生存环境，形成生物屏障。此前，关于黏膜生物屏障的研究更多集中于黏膜菌群，由于有细菌的地方就会有噬菌体存在，因此，噬菌体在黏膜表面的分布与功能以及对机体健康的作用也逐渐受到关注。

近些年的研究表明，噬菌体可黏附于黏膜并发挥抗菌作用。Barr等[11]发现，噬菌体在黏膜黏液层内平均浓度比邻近非黏膜环境高出4.4倍，且该种现象依赖于细胞表面黏液的存在，并通过体外噬菌体黏附试验提出BAM模型(bacteriophage adherence to mucus)，即噬菌体通过其衣壳表面的蛋白多聚体，如T4噬菌体衣壳表面具有4个Ig(immunoglobulin)样折叠的Hoc蛋白，与黏蛋白表面的高变异性多糖相结合来黏附于黏膜表面，通过烈性噬菌体对细菌宿主的裂解和子代病毒的产生减少黏膜表面病原菌的定殖，形成一种非宿主来源的免疫。黏蛋白是黏膜器官(如肠道)黏液层中主要的结构组分，在黏液层中呈现梯度分布，黏蛋白浓度从上皮细胞侧至腔侧逐渐降低；黏膜上皮细胞分泌黏液补充黏液层与黏液层从腔侧脱落流失处于动态平衡中，使黏液层保持一定的厚度，在此基础上，黏液层中的微生物群落也处于不断周转的状态。最近的研究表明，在中低黏蛋白浓度下，T4噬菌体可通过Hoc蛋白与黏蛋白短暂结合而减慢移动速度，表现出在黏液层中的亚扩散运动，由此在黏液层中适宜的浓度区域形成亚扩散区，亚扩散运动可以使T4噬菌体更加彻底地搜索局部黏液层网络中黏附的细菌宿主，从而可在低宿主菌浓度时提高噬菌体与细菌宿主的相遇概率，增强抗菌效果[12]。此外，关于溶原性噬菌体和裂解性噬菌体在肠道黏膜的分布，有学者最近提出一种新的细菌-噬菌体互作动态模型，即Piggyback-the-Winner(PtW)，该模型认为，在高微生物丰度和高生长速率时，溶原状态占主导地位，并根据肠道黏液层浓度梯度推测，溶原作用主要发生在黏液层的顶部，而裂解性噬菌体的捕食主要发生在细菌稀疏的中间层[13]。

噬菌体黏附于黏膜的现象不仅发生于体内的黏膜组织，对于存在于体外的黏膜同样适用。Almeida等[14]的研究证实，柱状黄杆菌噬菌体FCL-2可在虹鳟鱼表面黏膜存留1周以上，在柱状黄杆菌攻毒前3 d使用FCL-2处理可延迟发病时间，显著提高虹鳟鱼存活率。

2 噬菌体跨黏膜转位

噬菌体在黏膜表面的黏附增加了其与上皮细胞接触的机会。但由于真核细胞与细菌有着截然不同的细胞受体和胞内机制，普遍认为噬菌体不能感染真核细胞。然而，大量噬菌体疗法研究结果表明，在经黏膜的给药方式下(如口服、鼻内)均可在血液中检测到噬菌体的存在，随后跟随血液转移到体内各种组织器官，如脾、肝、肾，甚至大脑[15-17]。

关于噬菌体跨越黏膜上皮进入人体内的机制目前有几种假说[18]：1)“肠漏”假说，肠道患有炎症时细胞受损，脉管系统被刺破，从而可使噬菌体绕过上皮层；2)“特洛伊木马”机制，即噬菌体感染或整合进入细菌宿主，而细菌宿主又被吞噬或进入真核细胞，随后噬菌体裂解宿主菌，释放子代颗粒；3)噬菌体展示机制，工程化噬菌体被设计展示与某种细胞表面整合蛋白相互补的多肽，进而引起受体介导的内吞作用；4)细胞通过内吞作用自由摄取噬菌体。在一般情况下，噬菌体多是通过第4种途径，即胞吞作用，进入机体。Nguyen等[19]利用在体外培养的来源于肠、肺、肝、肾和大脑的细胞系，发现噬菌体的胞吞转运作用在方向上具有对从顶端到基底外侧转运的明显倾向性，噬菌体颗粒存在于膜结合的囊泡内，并在细胞质内自由漂浮，经过内膜系统转运，可在所有的亚细胞器内检测到。囊泡包裹的内化噬菌体颗粒可能在胞内被降解，导致噬菌体颗粒和遗传物质的释放，其中，遗传物质可被真核细胞机制转录和翻译[20-21]。

另外，细胞对噬菌体胞吞作用的强弱以及胞吞机制可能与细胞类型以及噬菌体自身特性有关。Tian等[22]在研究丝状M13噬菌体内化进入上皮细胞系(HeLa细胞系和人乳腺癌细胞系MCF-7)和内皮细胞系(人真皮微血管内皮细胞HDMEC)的机制时发现，M13噬菌体与细胞互作具有细胞类型依赖性，多倾向于附着在上皮细胞的细胞膜上，而不是内皮细胞；M13噬菌体通过内吞进入各类细胞，但对于不同类型细胞表现出不同的内吞机制：通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用进入HeLa细胞；通过囊泡运输、网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用进入MCF-7；通过质膜凹陷形成微囊介导的内吞进入HDMEC。Lehti等[23]发现，大肠杆菌PK1A2噬菌体与真核神经母细胞瘤细胞的结合和渗透是通过与该类型细胞表面的聚唾液酸相互作用，其结构与细菌的噬菌体受体相似，并通过内溶酶体途径内化，可在细胞内存活1 d而不影响细胞的活性，最终噬菌体在溶酶体中降解。

噬菌体在上皮细胞层的胞吞转运作用为无疾病状态下人体内噬菌体的出现提供了一种机制上的解释。成功穿过上皮细胞层的噬菌体可能进入间隙基质，从这里，噬菌体可以流入淋巴系统，随后能够进入局部淋巴结、循环系统，最终传播到全身各个器官，在体内积累形成“体内噬菌体组”[18]。如经尾静脉注射表达绿色荧光蛋白的T4噬菌体后，可在小鼠的脾和淋巴结内检测到该种噬菌体的聚集[24]。噬菌体被证明可通过血脑屏障(BBB)，并通过轴突运输在灵长类动物的大脑中扩散，在脑内积累并介导保护性的抗菌作用[18, 25]。

目前，对噬菌体跨黏膜转位进入机体的研究仍十分有限，根据细胞种类或噬菌体种类的不同可能存在着更多复杂的机制，因此，需要更多的研究来探索与发现噬菌体与真核细胞之间的互作情况及其机制。

3 噬菌体与机体免疫系统的互作

噬菌体转位后进入固有层会与黏膜相关淋巴组织相互作用；进一步随血液迁移到远处的组织，使之能够在血液和其他器官或组织中与免疫细胞相互作用。噬菌体属于外源的免疫原性物质，相应地会刺激机体免疫系统(包括先天性免疫和适应性免疫)，产生促炎或抗炎反应，机体随即会对这些外源性物质产生免疫反应，如吞噬作用和产生特异性抗体从而清除噬菌体。

3.1 噬菌体与炎症反应

噬菌体一旦与免疫细胞接触，就有可能诱导产生不同的抗炎或促炎细胞因子，使之有机会影响机体整体免疫。

3.1.1 抗炎特性 近年来发现，噬菌体在体外具有抑制免疫反应、抗炎症的特性，似乎与它们的抗菌活性无关，但可能与具体的噬菌体特性以及作用的部位有关。

3.1.1.1 抑制淋巴细胞活化增殖：Mankiewicz等[26]研究表明，经腹腔接种结核菌噬菌体的豚鼠对结核菌素的皮肤反应明显下降；当添加到淋巴细胞培养物中时，结核杆菌噬菌体可以剂量依赖性地抑制植物血凝素(PHA)诱导的淋巴细胞活化。Górski等[27]证实，T4噬菌体可抑制小鼠模型中同种异体皮肤排斥反应，减少同种异体移植物的免疫细胞浸润，抑制体外同种异体抗原诱导的免疫球蛋白的产生以及小鼠的特异性抗体反应，并减少小鼠T细胞增殖和NF-κB活化。另有研究证实，一些噬菌体(如T4大肠杆菌噬菌体)可表达结合细胞表面β3整联蛋白(主要是αIIbβ3)的Lys-Arg-Gly(KGD)序列(位于衣壳蛋白gp24)，从而结合β3+细胞(血小板、单核细胞、一些淋巴细胞和一些肿瘤细胞)，通过抑制整联蛋白的功能而下调这些细胞的活性[28]。该序列也存在于CD40配体(CD40L)中，已知CD40L可激活内皮和血小板并刺激炎症，并且对于T淋巴细胞和B淋巴细胞活化至关重要，CD40与CD40L相互作用的中断具有较强的免疫抑制特性[29]。

3.1.1.2 促进抗炎相关细胞因子的释放或抗炎标志物基因的表达：Zhang等[30]在体外研究中发现，金黄色葡萄球菌噬菌体vB_SauM_JS25可降低由金黄色葡萄球菌或脂多糖(LPS)诱导的牛乳腺上皮细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10和RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)的mRNA水平，介导抗炎效果。此外，Van等[31]发现，体外条件下5种不同的高纯化噬菌体均可诱导人外周血单核细胞产生明显的、可重复的免疫反应，抗炎标志物如细胞因子信号转导抑制分子3 (SOSC3)、IL-1受体拮抗剂(IL1RN)在不同噬菌体处理后均有类似的上调，并且观察到的免疫反应被证明是不依赖内毒素的，且主要是抗炎症反应。

3.1.2 促炎特性 噬菌体与免疫系统的互作并不局限于其抗炎特性，有证据显示，有些噬菌体亦可引起促炎反应。体外试验表明，金黄色葡萄球菌噬菌体纯化制剂A20/R对由丝裂原伴刀豆蛋白A(conA)激活的脾细胞增殖具有共刺激作用，并诱导脾细胞培养物中促炎细胞因子IL-6的产生[32]。Gogokhia等[33]发现，口服纯化的大肠杆菌噬菌体，引起无菌小鼠派伊尔氏淋巴结中产生IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞的扩增。体内试验表明，腹腔注射具有免疫原性的肿瘤特异性W13丝状噬菌体可使中性粒细胞浸润，引起小鼠肿瘤消退[34]。进一步的机制分析发现，噬菌体以TLR(toll-like receptors)依赖的方式刺激正常小鼠巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌促炎细胞因子(TNF、IL-6和IL-1)，并增加参与抗原递呈和共刺激的分子表达，刺激TAMs分泌促进中性粒细胞募集的因子，增强中性粒细胞介导的肿瘤破坏[35]。

尽管绝大部分研究表明噬菌体具有抗炎或促炎的特性，但也存在噬菌体不引起免疫反应的情况。Freyberger等[36]在体外试验中发现，金黄色葡萄球菌噬菌体K对单核细胞来源的树突状细胞的促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达，以及MHC-Ⅰ/Ⅱ和CD80/CD86蛋白的表达几乎没有影响，由于树突状细胞是先天免疫系统和适应性免疫系统之间最强的抗原递呈细胞之一，表明噬菌体K不会独立地影响整体免疫或对其影响非常有限。

3.2 噬菌体与抗病毒先天性免疫

哺乳动物细胞可以通过模式识别受体检测进入细胞内部的病毒核酸，从而引起抗病毒的先天性免疫反应。这些受体包括感知病毒RNA的TLR-7、TLR-8和RIG-1；感知DNA的TLR-9和GMP-AMP(cGAMP)环化酶，模式识别受体通过识别病毒核酸启动下游信号级联反应，从而激活Ⅰ型干扰素、炎性细胞因子(如IL-6和IL-1β)和趋化因子(包括IL-8和CXCL-10)的表达[37]。

噬菌体可能在机体细胞内产生mRNA，进而通过模式识别受体对机体免疫产生干预。如Gogokhia等[33]在体外研究中发现，与噬菌体或噬菌体衍生的DNA共培养的树突状细胞可以产生多种细胞因子，包括IL-12、IL-6和IL-10，并通过一种依赖于TLR9但独立于TLR3的信号转导刺激CD4+T细胞产生IFN-γ。Sweere等[38]发现，小鼠和人类白细胞可内吞Pf(一种丝状噬菌体)，使这种单链DNA病毒内化，产生噬菌体RNA，从而激活TLR3和干扰素βTIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖性Ⅰ型干扰素的产生，该细胞因子反过来又抑制巨噬细胞产生TNF，从而影响吞噬作用和细菌清除，延缓伤口愈合。

综合分析目前有关噬菌体对机体免疫影响的研究结果，发现噬菌体更多表现出抗炎特性。噬菌体可能通过降低机体免疫反应，来减少从机体中被清除和降解的机会。噬菌体对免疫系统的影响可能同噬菌体类型、试验条件(体内/体外)、机体在试验时所处的状态(疾病/健康)有关。另外，即使是同一种菌的噬菌体，如上文中提及的不同株金黄色葡萄球菌噬菌体(金黄色葡萄球菌噬菌体vB_SauM_JS25、金黄色葡萄球菌噬菌体纯化制剂A20/R、金黄色葡萄球菌噬菌体K)，同是在体外条件下却表现出不同的结果(抗炎、促炎、无影响)，这可能同试验中是否存在宿主菌和所用的细胞类型有关。当然，目前关于噬菌体对机体免疫系统影响的研究还很少，仍需要开展更多的研究以揭示噬菌体对机体免疫系统的调节作用。

3.3 噬菌体的清除

吞噬细胞对外来物的一种可能的反应是产生活性氧(ROS)。Borysowski等[45]发现，纯化T4噬菌体制剂以剂量依赖的方式增加全血中单核细胞和中性粒细胞活性氧的产生，但与热灭活的金黄色葡萄球菌细胞相比，噬菌体诱导的呼吸爆发强度要低得多，同时，试验中另一种噬菌体制剂(A3/R)则并未引起明显的呼吸爆发，这间接说明了转位至体内的噬菌体不太可能引起组织器官的氧化损伤。但噬菌体对于由细菌诱导的呼吸爆发具有重要影响，研究发现，T4噬菌体可以显著降低不同大肠杆菌中脂多糖(LPS)以及活菌诱导的外周血多形核白细胞(PMNs)活性氧的产生，并且这种效应不依赖于细菌对T4介导的裂解的敏感性[46-47]。噬菌体介导的该种效应，可防止由细菌诱导产生的过量活性氧对机体造成氧化应激和组织损伤。

3.3.2 噬菌体中和抗体 正常机体血液内天然存在噬菌体中和抗体[48]，这可能是由于持续的外源噬菌体向体内转位造成的[19]。噬菌体是外源的免疫原性物质，能刺激体液免疫反应，诱导产生噬菌体抗体，但噬菌体的免疫原性较弱，机体免疫系统可产生低浓度的噬菌体中和抗体而不引起炎症反应。Majewska等[15]发现，长期在小鼠饮水中加入高滴度的T4噬菌体(4×109pfu·mL-1)可以激活体液免疫，诱导肠内特异性的分泌型IgA反应和血清IgG反应，但该免疫刺激反应相对较弱。因此，在医学上，基于这种低免疫原性，可通过免疫接种噬菌体检测T细胞功能及噬菌体特异性抗体的产生来评估免疫缺陷患者的免疫能力[49]。

除了将整个噬菌体视为一个整体外，评价单个噬菌体蛋白引起的免疫反应同样具有意义。Dąbrowska等[48]在正常人群血液中发现了针对T4噬菌体蛋白gp23*、gp24*、Hoc和Soc的天然IgG抗体，其中，针对T4主要衣壳蛋白(gp23*)的特异性抗体占优势，而并不是高抗原性的外衣壳蛋白Hoc；另外，在分析这4种头部蛋白各自的免疫原性时发现，IgM和IgG抗体主要是由gp23*和Hoc诱导的，由此，作者认为，这两种蛋白是对噬菌体免疫记忆起显著作用的头部蛋白。另一针对T4噬菌体的不同结构蛋白对于体液免疫影响的试验发现，噬菌体T4 Hoc蛋白和gp12强烈刺激IgG(血液)和IgA(肠道)抗体的产生，具有高免疫原性，而gp23*、gp24*和Hoc只诱导了较低的抗体产生[15]。以上两个针对T4噬菌体蛋白试验结果的差异可能是由于不同的给药途径造成的，前者是通过腹腔注射不经过肠道，而后者是经口给药，说明噬菌体蛋白乃至噬菌体给药途径不同都会对机体抗体的产生造成影响。

4 小 结

目前，对人及动物体内噬菌体组的研究依然处于初级阶段，大量新型噬菌体还有待发现，对噬菌体黏附于黏膜和转位机制、对噬菌体进入体内之后与免疫细胞的互作及这种现象对机体的潜在影响，更是需要大量的工作来提供数据支持。此外，还需要进一步的研究来阐明噬菌体在机体细胞内的运输和释放机制以及可能发生的信号转导，为在细胞水平、分子水平研究噬菌体提供理论参考。深入了解噬菌体在黏膜与菌群和动物宿主的互作将会为人们理解和调控黏膜免疫系统乃至调控机体免疫状态提供理论依据。