中药组方优化试验设计方法概述

王玉珊，林德贵，林珈好

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

“组方”这一概念在中医古代文献中并未明确提出，其含义来源于“制方”，在1958年《中医学概论》中出现后，开始广泛应用于中医学领域[1]。组方即组药成方，是根据一定的中医理论和组成原则选择合适的药物进行妥善配伍以组成方剂的过程。通过合理的配伍组合，达到调和药物之间性质、减轻药物毒性、应对复杂病症的目的。组方优化是通过筛选药味将原本繁杂的方剂简化或优化剂量配比，得到效应最佳的组合。中兽药组方优化的目的是增强方剂的临床针对性和稳定性，利于产业化推广和临床普及。

现代兽医学许多复杂疾病的治疗仅靠单一药物难以获得预期疗效，而中药及其复方具有整体性、多成分和多靶点协同作用的特点，因此吸引了许多学者加入中兽药现代化研究。对中药复方的深入研究丰富了中医理论，也为组方优化研究提供了理论支持。通过对经典方剂或临床经验组方的再优化获得新方是一种新思路，既保留了中医传统理论的配伍原则，又满足了现代医学对中药方剂的应用需求。

组方优化的试验设计和数据分析是以方剂为基础的中药研究的重要一环，研究者们在不断探索新的试验方法，希望能结合传统中医的内涵与现代医学的亮点。目前，针对中药单一药味或中药单一有效成分的研究已经很深入，但以复方为对象进行研究的却并不多。本文收集了近5年在组方优化研究中应用的方法进行分析，发现组方优化的研究方法主要分为两大类。第一类是基于传统的中医理论[2]的优化方法，即遵从“君臣佐使、七情配伍”，并根据药物的性味、归经等配伍原则进行药物的优化组合，或是按照治法的不同进行配伍加减优化。第二类是基于现代医学数理模型的设计方法，将药效等评估指标进行量化，拟合数理模型对影响因素和效应值进行统计与计算，达到精准的筛选优化。第二类主要包括正交设计[3]、均匀设计[4]、基线等比设计[5]、效应面优化法[6]、Plackett-Burman筛选试验设计[7]等方法。

1 组方优化的指导思想

君臣佐使理论是中药配伍研究中不可或缺的重要指导原则，七情配伍是中药配伍的基本形式, 四性五味是决定中药功效，指导中药配伍应用的重要依据[8]。徐群等[9]利用君臣佐使理论研究不同配伍组对和厚朴酚与厚朴酚含量的影响，结果显示君臣配伍在一定程度上能够代表全方。全方中无论是缺少佐药还是使药，都不会显著影响最终的药效发挥。传统中医理论所认为的方剂的整体性，是当药物组成复方时，不再针对单独的一味药，而是将全方或药对组合作为整体来探究其药理作用。学者们对于配伍规律的深入研究为组方优化研究奠定了基础，数据挖掘方法常被应用于中药的配伍规律研究中，常见的如聚类分析[10]、关联规则[11]、遗传算法[12]、FP-growth算法[13]、贝叶斯网络[14]等。

王庆国等[15]在名优中药的二次开发的思路中提出要明确“部分替代、局部优化、质量可控、疗效提高”的指导思想；提出疾病模型和药效学指标的选择应针对性强且符合国际化标准，在对结果进行评价时，要选取能够准确反映组方作用靶点的主要效应指标。例如小鼠心肌缺血疾病模型及其死亡率、心电图、心脏指数、血清心肌酶谱等指标是国际上研究药物对心肌疾病作用的常用模型和药效学指标[16]。

2 基于传统中医理论的研究方法

2.1 药对研究

药对简单来说就是指两味药配伍组方，一般遵循相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反的配伍原理[17]，通过药对配伍来达到增效减毒的作用[18]。苏杉等[19]通过探究秦艽的不同配伍药对对于风寒湿痹型类风湿关节炎大鼠的相关因子表达和病理学相关改变，得到药对组合为平温相配的秦威组(秦艽-威灵仙)的治疗效果最佳。杨延泽等[20]选取不同的温里药与当归进行药对配伍，研究不同药对对寒凝血瘀大鼠的血液流变学的影响，结果显示，药对模型组大鼠的颈总动脉以及心脏血流动力学指标和血液流变学指标得到显著改善，其中，当归配比吴茱萸组改善效果最为明显，得到治疗效果最优的药对当归-吴茱萸。周丽萍等[21]选取柴胡-黄芩药对的不同剂量配比对抑郁小鼠进行试验，探究其对行为学及相关信号通路的影响，结果表明柴胡-黄芩(1∶1)及柴胡-黄芩(8∶3)配伍的抗抑郁效果较好。顾俊菲等[22]研究芍芎组分保护缺氧损伤细胞的作用，以MDA、NO含量和SOD、LDH活性为指标,比较赤芍总苷：川芎总酚酸在不同配比下的差异，发现赤芍总苷:川芎总酚酸8∶2时抗氧化作用最好，抗凋亡效果也很突出。

与优化经典方剂相比，对于药对的探索和挖掘显得更加具有创新性和启发性。具有不同药效的药对可以为新组方的研发提供思路，例如宋亚刚等[23]通过整理大量文献寻找毒性相畏的中药，结合临床主治病症对潜在解毒中药进行分类，挖掘潜在的减毒药对；并提出针对潜在药对可以进行毒理研究，验证是否存在减毒效果，以此得到最佳的减毒药对或减毒配比。

2.2 加减配伍

加减配伍是为了贴合临床治疗，针对不同的病症或病患，在原有组方的基础上进行药味的增加或减少，是临床中广泛应用的一种简单快捷组方优化方法。赵雪莹等[24]通过研究比较桃核承气汤及其拆方 (全方去大黄、全方去桂枝、全方去桃仁)对于大鼠肾间质纤维化模型的作用,结果显示全方及其拆方均能发挥较好的抗肾间质纤维化作用。全方作用最强,拆方中桃仁与大黄作用较桂枝明显。苗磊等[25]从经典方剂中选取用于治疗元气虚弱的“鹿茸酒”及“独参汤”，对其进行单独和组合研究，筛选出优秀的抗疲劳方剂，结果表明鹿茸酒加独参汤的组合方相比原方能显著缓解小鼠疲劳，增强小鼠运动时间和提高ATP、肝糖原等的含量，且得到最优配比(鹿茸∶人参∶山药为1∶3∶18)。

3 基于数理模型的设计方法

3.1 正交设计

正交设计(orthogonal design)[26]通过一套正交表进行试验设计，特点是整齐可比，各因素水平能均衡分散，且能很好地消除因素之间的干扰。简单、快捷且高效是正交设计的最大优点，所以它在中药复方的组方优化中应用最为广泛[27-28]。但由于每个因素与水平都需要重复，随着考察因素和水平的增多会导致试验组变得繁多，同时增加了数据分析的难度和结果的不稳定性，失去了其快速高效的优点。正交设计常用于考察单因素的主效应，而药物之间的交互作用常被忽略，故正交设计适用于因素水平不多且交互作用不明显的组方优化。闫亚楠等[29]采用正交设计法优化当归芍药散对于治疗慢性盆腔炎模型大鼠的组方，以病理结果及相关炎症因子水平为观察指标，分析得出芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻五味中药的结果具有显著性意义，且优化后配方可通过抗炎和改善病理损伤达到治疗目的。

3.2 均匀设计

均匀设计(homogeneous design)[30]通过一套均匀设计表进行试验设计，是继正交法之后建立的数学模型，克服了正交试验中因素和水平数受限、试验次数多的弊端。其特点是设计试验点在范围内“均匀散布”，只需要进行与水平数等同的试验次数就可以获得较为全面有效的结果。但由于它舍弃了正交设计的整齐可比，所以在结果上可能会出现较大的误差，可以通过加入误差列和交互作用列对结果进行考察以减小误差。均匀设计结果呈线性变化，适用于因素和水平数较多的情况，可以有效地提高效率。刘琳等[31]采用均匀设计对玉女煎的降血糖作用进行组方筛选，得到方中作用的主次顺序：熟地黄>石膏与知母交互作用>石膏>牛膝，且优化后的配方降糖作用良好。杨传华等[32]采用均匀设计，考察人参健心胶囊所含八味中药的抗心肌缺血效应，分析优选得到最佳配比组方为人参1.62 g、黄芪4.62 g、丹参2.43 g及泽泻1.66 g。

3.3 基线等比设计

基线等比设计法是商洪才等[33]建立的一种适用于中药小复方的设计法。它以复方中两药的药典比例作为中心点(基线)，在中心点的周围按照一定的增减比例放置数个试验点，通过重复循环的多次试验对效应进行观察和计算，优化复方的配比。只适用于药效明确且只含有两种药的中药小复方，主要应用于优化剂量配比。王霜等[34]将葛根芩连汤进行拆方，采用基线等比设计法探究其中的抗消渴组方葛根-黄连的不同配比对小鼠糖尿病模型血糖的影响，得到的最优配比为葛根∶黄连=3∶8，证明此方法有一定的科学性和实用性。田枫等[5]采用基线等比增减设计法设置黄芪注射液-灯盏细辛注射液不同剂量配比组共6 组，筛选黄芪注射液联合灯盏细辛注射液抗大鼠脑缺血再灌注损伤的最佳配比，评估各组小鼠的神经功能缺损评分和血清MDA含量、血清SOD活性及脑梗死率等，得出最佳配比为黄芪注射液∶灯盏细辛注射液=4∶6。

3.4 Plackett-Burman筛选试验设计

Plackett-Burman筛选试验设计(PBD)[35]是一种多因素两水平的试验设计方法，可以在多个因素中快速筛选出有显著效应的因素，在各个领域都有广泛的应用，常被应用于配方优化中进行条件筛选[36-38]。尽管此方法并不考虑任何的因素间交互作用，但经济高效的特点使它受到广大学者的欢迎，所以此方法也适用于组方中因素众多且各因素间的影响不确定的情况。郑婷婷等[7]采用Plackett-Burman以抑制肺炎细胞增殖作用为效应对复方金复康进行组方优化。通过随机森林模型结合网格化搜索算法得到最佳组方并通过试验验证优化方相比原方具有更好的效应，证明此方法可以在组方优化中应用。马芳等[39]通过Plackett-Burman以基于细胞水平的抗炎作用为评估指标，筛选桔梗汤与桑菊饮复方中效应最优的三味药：甘草、桑叶和陈皮。

3.5 星点设计

星点设计(central composite design,CCD)是一种多因素5水平的设计方法，是在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，星点设计常常和效应面优化法相结合，在药物的提取工艺和处方优化等领域被广泛应用，具有精准筛选和预测的优点[40]。效应面优化法(RSM)[41]是通过构建非线性模型即三维效应面图展现因素与效应的关系，然后从效应面上选取最佳效应点或范围的设计方法。也可利用效应面法对各因素水平的效应和因素之间的交互作用进行准确的预测。效应面优化法实行的重要条件是所有因素变量都必须连续可控，以此保证构建的模型的准确性。汪玉梅等[42]利用响应面法优化肾气丸组方的最佳剂量配比，以各组小鼠肾阳虚临床症状变化情况以及血清中促肾上腺皮质激素、皮质醇的含量变化为观察指标，通过优化并进行验证试验得到小鼠肾气丸各药物最佳配伍比例:附子∶肉桂∶干地黄∶山药∶山茱萸∶牡丹皮∶泽泻∶ 茯苓=2∶2∶8∶4∶4∶6∶6∶6。黄云等[43]利用星点设计-效应面优化法对双苷清咽含片进行优化，结果含片的抗炎药效取决于芒果苷和罗汉果甜苷的用量，优选出最优处方为芒果苷占素片片重13.00%，罗汉果甜苷占9.75%，薄荷脑占0.30%。邓丽红[44]采用二因素五水平的星点设计法，探讨泻心汤的不同剂量配伍对其化学成分溶出的影响。试验选取了3种化学成分(蒽醌类、黄酮类及黄连生物碱类成分)的溶出率为验证指标，结果得到了3组较优的剂量配比：大黄∶黄连∶黄芩=6∶0.17∶5.83，黄芩∶大黄∶黄连=3∶1.76∶0.17，黄连∶大黄∶黄芩=3∶4.95∶5.83。

3.6 中心组合设计

中心组合设计(Box-Behnken design，BBD)[45]是多因素3水平的试验设计，也常与效应面优化法结合称为Box-Behnken效应面优化法(BBD-RSM)，与CCD相比，BBD所需要的因素水平更少，但得到的结果准确性却不会受到影响，是一种更经济的选择[46]。BBD-RSM已在食品工艺、生物制剂等领域得到广泛的应用[47-49]，在中药组方优化试验中尚处于初步探索阶段，已被用于药物制剂的配方优化等。睢博文等[50]采用单因素试验结合BBD优化复方人参健体方中四味药的配比，得到的最优处方配比为人参1.5 g、山药10 g、枸杞子10 g、益智仁3 g，结果显示优化后的处方较原方具有显著的抗疲劳疗效。邱玲玲等[51]采用BBD-RSM筛选双黄连注射液中抑制流感病毒神经氨酸酶活性的组分中药，对最佳配比进行预测并进行验证，结果表明BBD-RSM对最优组方的预测有一定准确性。

3.7 Doehlert设计

Doehlert设计[52]采用k2+k+1次试验次数(k= 因子数)，可以有效地分析因素对于变量的影响大小，且可以观察到因素间的相互效应。此方法也是将变量关系扩展到曲面上进行分析，是一种预测性较好的试验设计方法，在化工业、制造业、生物技术等领域被应用于考察主次效应、优化反应条件、优化配方等[53-54]。在药理学的应用主要在可以用于分析药物的相互作用关系。谢臻等[55]应用此方法，探究枳实、厚朴和芒硝的剂量配伍变化对大黄蒽醌类成分在整方中溶出的影响，得到溶出率最高时的最优配比为大黄∶枳实∶厚朴∶芒硝=1∶4∶2.31∶2。

作者将以上基于现代数理模型的试验设计方法的优缺点和适用范围进行了总结比较，详见表1。

其中正交设计和均匀设计作为经典设计法，其简单快捷的优点使它们在很长时间内被研究者们广泛应用在各领域。正交设计减少了试验次数，相比需要进行大量试验次数的全因子设计更有利[56]，例如5味药2个剂量水平的优化试验，全面设计需进行32次试验，而正交设计只需要6次试验；当药味增多时，建议只选取2～3个剂量水平进行试验，否则试验量会大大增加。若药味和剂量水平数众多且无法减少时，可以选择均匀设计，只需进行与水平数相同的试验次数。例如7味药8个剂量水平的均匀设计只需进行8次试验，而同样的设计如果采用正交试验则需要64次试验，所以相比之下均匀设计可以快速地了解组方的基本情况，如药效的强弱和主次。但均匀设计由于试验次数过少导致数据不够全面，有时会出现误差大的情况，且对于各因素效应也只是基本覆盖，并不能准确地说明问题，所以并不能用于精准筛选和优化。

基线等比设计则只适用于药效明确的药对或只有两味药的小复方研究，它将两味药的剂量水平按梯度安排在基线的附近，通过大量的试验以得到精准的优化，故在应用上有很大的限制。Plackett-Burman筛选试验设计可以快速筛选出显著性参数，所以适用于5种药味以上的组方筛选和优化，常作为优化试验的第一步，往往不考虑药物之间的相互作用，只考虑因素和效应之间的直接关系。适用于新方剂的挖掘和筛选，例如对经典书籍药方、民间药方、经验药方等进行初步的探索优化，可以快速得到优化结果，避免后期优化试验由于因子数过多而浪费资源。

表1 不同试验设计法应用对比

BBD、CCD、Doehlert设计具有一定的相似性，都适用于因素水平不多且变量连续可控的试验，也就是说对于试验对象的要求更高，不适用于药味剂量变化不规律、药效指标不明确、易受主观因素影响(例如症候评分)等情况。如果试验对象不符合要求，可能会导致无法绘制标准曲线，进而导致模型构建失败。它们的不同之处在于，同样因素水平的优化试验，BBD相比CCD的试验次数更少，更加经济实用，同时BBD没有极值点的设计，即在组方优化试验中不会出现所有药味均为最高剂量的试验组，因此对于一些有安全要求的试验极为适合。此外，BBD需设置一中心点，此中心点对结果起决定性作用，如果中心点的设置偏差太大，会导致优化失败，所以BBD更适合于有明确药效范围的组方优化。CCD法由于设置了两个极值，同时还要进行中心点的重复试验，所以试验次数会稍多，但此方法得到的数据更完整全面，适合于药效范围尚不明确，需要精准优化的组方。Doehlert设计的试验次数与BBD相似，它更注重因素之间的相互作用，适用于药味间相互作用明显的组方优化。

CD、BBD、Doehlert设计都是与RSM相结合的设计法，与正交设计和均匀设计不同的是，后两者是拟合线性模型的设计，前三者是拟合非线性模型的设计。在中药组方研究中，效应与因素之间也不完全都是呈现线性变化的关系。呈非线性变化的数据如果拟合线性模型，效应值在最佳试验条件附近变化灵敏，不易观察到，所以会导致优化失败。应用非线性模型时，最优区域的效应面弯曲度往往最明显，可以提高优化的成功率并且降低效应值与预测值之间的误差，精准度大大提升。但当考察因素增多时，试验次数成倍增长，使得试验设计和数据分析都变得更加复杂，这可能是效应面优化法无法在组方优化研究中快速普及的原因之一。

每种试验设计方法有其优势和不足，为了获得更优的试验结果，研究者常常将试验方法结合使用，建立更精准的模型。例如正交试验与均匀设计相结合[57]，Plackett-Burman与CCD[58]或BBD[59-60]结合，先将组方中有效药物进行快速的筛选，可以有效地减少后续试验的考察因素和试验次数。

随着中药理论与现代医学理论的交流以及中医研究的现代化和国际化，许多基于数理模型的试验设计方法也不断被应用在中药组方优化试验中，这些探索性的试验在一定程度上结合了传统中医和现代医学，体现了科学性和先进性。从文献中不难看出组方优化的设计方法发展的趋势，是要求试验设计法能利用更少的试验次数获得更加全面的试验结果，从而提高效率，也节省成本。这就使得研究者们需要不断从其他行业引入新的试验设计方法应用在中药组方研究中，在工业、生物制品等领域中还有许多先进方法值得学者们借鉴使用。需要强调的一点是，这些方法适用于因素与效应指标可以精准量化的试验，例如客观指标相关蛋白、因子指数等，可能不适用于带有主观因素的标准，例如主症与次症，症候轻重等。工业中广为应用的田口设计(Taguchi design)[61]，是利用正交表的三步设计法，添加了评测稳定性的参数比，优点是可以得到稳定性最优的最佳组合，适合于中药组方复杂不稳定的性质，值得探索。除了试验设计以外，研究者们也可以聚焦预测算法。例如向量机回归算法(support vector regression, SVR)[62]、多目标遗传算法优化[63]、随机森林算法[47]等。中药组方的研究常常涉及到大量的试验数据和模型，意味着需要大量的资源，即使条件允许也很难做到一次性获得所有数据，而这样的操作会导致更多的误差出现。利用预测算法可以省去重复的试验步骤，只需完成因素的标准曲线，更多的是通过计算机软件进行模拟试验并推算出最优组合，最后进行验证试验，此类方法也值得在组方优化研究中深入探讨和推广应用。