葛根素联合磷酸三钙支架的制备及对激素性股骨头坏死大鼠的修复作用研究

唐 华，万锐杰，刘 伟，陈 倩

(1.四川现代医院骨科，四川 成都 610000 2.重庆市中医院康复科，重庆 400021 3.重庆医科大学附属第三医院骨科，重庆 401120 4.重庆医科大学基础医学院，重庆 400016)

激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)是一种常见的骨科非创伤性股骨头坏死疾病，是由于过量或长期不当使用激素导致脂质代谢紊乱，干扰了正常的股骨头血供过程，进而致使股骨头部分区段骨小梁与骨髓坏死，最终导致骨骼结构发生改变。SANFH在临床上早期无症状且难以诊断，因此，大多数患者在确诊时已经出现股骨头塌陷，一旦出现股骨头塌陷，SANFH病程就难以逆转[1]。利用骨组织工程学技术构建工程支架材料已成为治疗骨缺损的主要手段。天然胶原蛋白由骨骼矿物质组成，而磷酸三钙具有优良的机械强度和骨传导性，经常在研究中用作自体骨的替代物[2]。在不同的组织中制备生物材料作为生物支架，能够为组织中特定的细胞提供生长空间与结构支撑，并能够引导组织再生和控制组织结构。葛根素是从中药葛根中提取的有效活性成分，已有研究表明，葛根素能够促进成骨细胞增殖，对于治疗股骨头坏死大鼠也具有显著效果[3]。鉴于磷酸三钙和葛根素以上的特性，本研究通过构建葛根素/磷酸三钙支架材料，并将其植入激素性股骨头坏死大鼠的坏死股骨处观察其修复作用，以期为进一步治疗体内股骨头坏死奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验动物：60只清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量为(200±20)g，购自重庆医科大学实验动物中心。将大鼠饲养于温度恒定在24℃，湿度45%，12h/12h昼夜循环的饲养箱中，期间自由饮水与饮食。

1.2主要试剂与材料：骨细胞株MLO-Y4(上海中科院细胞库)，葛根素(纯度≥99%，中国药品生物制品检定所)，磷酸三钙(上海贝奥路生物材料有限公司)，MTT、DMEM、胎牛血清(Hyclone公司)，二甲基亚砜、胰蛋白酶、大肠埃希杆菌内毒素(Sigma公司)，甲基强的松龙(辉瑞公司)，碱性磷酸酶和骨钙素检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，HE染色试剂和免疫组织化学染色试剂(上海碧云天生物研究所)，Runχ2抗体和VEGF抗体(Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。

1.3方 法

1.3.1葛根素联合磷酸三钙支架的制备：参考吴涛等人[4]的方法进行制备，称取葛根素充分溶解于二甲亚砜中，将磷酸三钙材料置于溶液中，室温下在密闭容器内20.265kPa吸附8h，将材料取出，放在真空干燥箱内，在30℃将制备的材料进行真空干燥24h，采用60Co消毒，密封保存。

1.3.2支架材料表面形貌观测：将支架材料表面进行喷金处理后，置于扫描电子显微镜(SEM)下观察复合材料断面的表面形貌，孔隙及支架表面结晶情况。

1.3.3支架材料孔隙率和力学性能测定：根据文献测量支架孔隙率[5]，将支架材料置于盛满无水乙醇V1(cm3)的容器中，密封后静置10min，待支架材料被无水乙醇完全浸透，此时容器无水乙醇和充满无水乙醇的支架材料的总体积记为V2(cm3)，将充满无水乙醇的支架材料从容器中取出，剩余的无水乙醇体积记为V3(cm3)。计算公式：孔隙率(%)=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。把支架材料置于万能材料试验机上进行力学性能测试，横杆垂直方向的加载速率设置为0.1mm/min，记录支架材料破碎的最大负荷值，计算公式：压强(P)=支架垂直受力(F)/支架受力面积(S)。

1.3.4葛根素/磷酸三钙支架材料浸提液的制备：将葛根素/磷酸三钙支架材料置于体积分数为75%乙醇中，浸泡24h，PBS缓冲液冲洗后，采用无菌纱布吸干水分，放入含有DMEM培养基培养瓶中，配成不同浓度的液体，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中浸提72h，采用20μm微孔滤膜过滤，制备支架材料浸提液。

1.3.5细胞培养、处理与增殖检测：将MLO-Y4骨细胞株以1×104个/孔的密度铺于96孔板上，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度(1×10-7、1×10-6、1×10-5moL/L)的葛根素/磷酸三钙支架材料浸提液，以磷酸三钙材料浸提液作为对照，各组分别于培养后24、48、72h，加入20μL的MTT，37℃孵育4h，弃原培养液并加入150μL DMSO溶液，持续振荡10min，使用酶标仪在570/630nm处检测吸光度(A)。

1.3.6扫描电镜观察：将葛根素/磷酸三钙支架材料切成小块，使用体积分数为75%乙醇浸泡24h，DMEM培养液浸泡3d，将支架材料放入24孔板，调整MLO-Y4细胞悬液浓度为2×105个/mL，取20μL细胞悬液加入材料表面，然后置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育。4h后补加1mL培养液，继续培养，每24h更换一次培养液。7d后将样本将支架材料进行喷金处理后，采用SEM观察材料表面细胞生长情况。

1.3.7大鼠分组、模型制备及处理：60只大鼠适应性喂养1周后，根据随机数字表法分为空白对照组、模型组、复合支架组，每组20只。模型组和复合支架组大鼠参照文献方法[6]造模，给予尾静脉注射脂多糖(LPS)(2mg/kg)，每天1次，持续2d，最后一次注射LPS后，腹腔注射甲基强的松龙(20mg/kg)，每天1次，持续3d，空白对照组大鼠同时注射等量生理盐水。2周后随机取材6只大鼠进行HE染色观察组织病理学变化，判断造模效果。造模成功后，复合支架组大鼠清理死骨，将葛根素/磷酸三钙支架材料植入股骨头孔隙坏死处，活动股骨，将植入支架材料卡压牢靠，缝合伤口。无菌敷料盖住，臀肌注射青霉素和庆大霉素，每日换药1次，持续3d。

1.3.8血清钙、磷、骨代谢指标检测：大鼠处理后12周进行空腹心脏采血，血液在4℃低速离心机中以4500r/min离心10min，取上清分离血清，经全自动生化仪检测血清样本中钙、磷含量，酶联免疫试剂盒检测骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)含量。

1.3.9Micro-CT扫描仪检测：12周后将大鼠处死，取两侧股骨，剔除股骨周围软组织，将左侧股骨沿平台长轴放置，采用Micro-CT扫描仪对左侧股骨进行扫描，使用CTAn图像分析仪测量骨矿物质密度(BMD)、小梁骨体积分数(Tb.BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数目(Tb.N)。

1.3.10HE染色：将各组大鼠的左侧股骨头组织在4%多聚甲醛中固定后，采用10% EDTA进行脱钙处理，每周更换一次脱钙液，连续处理2个月，直至针头可刺穿为止。梯度酒精脱水，进行石蜡包埋，在股骨头横径最大处切成厚度为4μm的切片，在二甲苯中脱蜡，梯度酒精复水，加苏木精染色5min，伊红染液中染色2min，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

1.3.11免疫组化染色：将制备的股骨头组织切片脱蜡至水，滴加2%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液高温下进行抗原修复，使用3%H2O2去除内源性过氧化物酶，滴加兔抗VEGF(1:200)与Runχ2(1:200)在4℃过夜，次日PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(1:1000)，室温下孵育1h，PBS冲洗后，滴加DAB，苏木精复染，中性树胶封片，在电镜下观察，组织中淡黄色、棕黄色颗粒即为阳性表达。

2 结 果

2.1葛根素/β-磷酸三钙支架的表征：通过SEM观察到，葛根素/磷酸三钙支架材料具有良好的多孔网状结构，内部孔隙相互连通，形成蜂窝状结构，平均孔径为200～300μm，见图1。

2.2孔隙率和抗压强度检测结果：与磷酸三钙比较，葛根素/β-磷酸三钙支架材料的孔隙率较小，差异有统计学意义(P<0.01)。磷酸三钙抗压强度值明显低于葛根素联合磷酸三钙组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 支架材料抗压缩测试结果比较

2.3葛根素/β-磷酸三钙支架对骨细胞活性的影响：与磷酸三钙组比较，不同浓度的葛根素/磷酸三钙支架材料浸提液在24h、48h、72h的细胞活性均显著提高(P<0.05)，呈现出剂量依赖性。且在48h、72h时，1×10-5moL/L葛根素/磷酸三钙支架组活性显著高于另外两个浓度作用下的细胞活性(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度的复合材料浸提液干预不同时间对MLO-Y4细胞活性的影响

2.4葛根素/β-磷酸三钙支架与细胞相容性：通过SEM观察MLO-Y4细胞接种至支架材料表面后细胞生长情况，在磷酸三钙材料表面MLO-Y4细胞平铺，呈贴壁生长的状态，由此说明磷酸三钙材料细胞相容性较好；在不同浓度的葛根素/β-磷酸三钙支架材料上，随载药剂量的增加，材料表面上贴壁生长的细胞数量增多，且在1×10-5moL/L葛根素/β-磷酸三钙支架材料表面观察到大量细胞聚集、叠层生长，见图2。

图2 扫描电镜观察葛根素/β-磷酸三钙支架与细胞相容性

2.5各组大鼠股骨组织形态学观察：HE染色结果表明，大鼠造模后股骨组织内骨小梁出现稀疏、不连续现象，坏死骨细胞扩散在骨小梁中，说明造模成功。治疗后，空白对照组中骨细胞核染色均匀，骨小梁排列整齐，间隔小且软骨表面光滑；在模型组中明显观察到骨组织出现空洞现象，骨小梁稀疏、结构紊乱，且间距增大；复合支架组骨小梁密集且排列较整齐，股骨组织病变得到明显改善，见图3。

图3 HE染色观察各组大鼠股骨组织病理学变化(×200)

2.6各组大鼠股骨组织光学检查和股骨骨密度测定：Micro-CT扫描观察股骨组织结果显示，与空白正常组比较，模型组大鼠股骨头出现严重坏死现象，同时BMD显著降低，Tb.BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著减少(P<0.05)。与模型组比较，复合支架组大鼠股骨头坏死现象得到明显改善，BMD显著升高，Tb.BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著增加(P<0.05)，见图4与表3。

图4 Micro-CT扫描仪检测各组大鼠股骨变化

表3 各组大鼠股骨头BMD Tb.BV/TV Tb.Th和Tb.N比较

2.7各组大鼠血清钙、磷、BALP和StrACP水平比较：与空白对照组比较，模型组大鼠血清中血钙、血磷水平显著下降，BALP水平显著升高，同时BGP水平显著下降(P<0.05)；复合支架组大鼠血清中血钙、血磷水平较模型组显著上升，BALP水平显著降低且BGP水平显著升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠血清钙磷BALP和BGP水平比较

2.8各组大鼠Runχ2、VEGF免疫组化检测：免疫组化检测结果显示，模型组大鼠股骨组织中Runχ2、VEGF阳性表达率均显著低于空白对照组(P<0.05)；与模型组比较，复合支架组中Runχ2、VEGF阳性表达率显著升高(P<0.05)，见图5与表5。

图5 免疫组化染色检测各组大鼠股骨组织中Runχ2、VEGF表达(×200)

表5 各组大鼠Runχ2 VEGF 免疫组化表达比较

3 讨 论

激素滥用是导致股骨头坏死的主要因素之一。在激素作用下，内皮细胞功能出现障碍致使股骨头血液循环受阻，导致了局部骨组织缺血和坏死[1]。对激素性股骨头坏死实施的治疗手段包括人工关节置换手术和药物疗法，然而大部分药物治疗没有表现出良好的临床效果[7]。目前，骨组织工程广泛用于修复骨缺损，组织工程的三要素包括种子细胞、生长分化因子和支架材料，已经使用几种方法均取得了进展，例如设计天然/合成聚合物复合材料，生物聚合物/骨诱导性生物陶瓷复合材料等[3]。近年来，将生物材料和生长因子结合起来构建支架材料以增强移植物的功能和骨组织愈合能力，已成为研究的热点内容。

骨组织工程支架材料的发展直接取决于材料技术的变化，用于骨再生的支架应具备良好的生物相容性，较高的机械强度以稳定骨组织的形成，并促进细胞的生长和分化[3]。支架材料的孔隙度也是评价支架材料一个重要的参数。孔隙率对于养分传输、血液供应、细胞新陈代谢产物排出都具有重要意义。多项研究表明，磷酸三钙作为生物活性陶瓷，具有良好的吸收性、骨传导性、细胞粘附性和机械性能，并且与宿主骨组织相容性好[8]。在本研究中，通过检测发现葛根素/β-磷酸三钙支架材料具有多孔网状结构，抗压强度较高，并且在作用于MLO-Y4细胞后，能够促进细胞的生长活性，说明具有良好的细胞相容性，特征与性能均符合骨组织工程支架材料的要求。本研究通过给予大鼠尾静脉注射LPS和腹腔注射甲基强的松龙建立了大鼠股骨头坏死模型，将葛根素/β-磷酸三钙支架材料植入大鼠股骨头坏死处进行干预后发现，大鼠股骨组织病变得到明显改善，骨小梁密集、排列整齐，且间隔均匀，股骨骨矿物质密度增加，小梁骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数目也均增加。说明在股骨头坏死处植入葛根素/β-磷酸三钙支架材料能够起到较好的骨修复作用。

血清和骨骼中钙和磷的浓度可以反映钙和磷稳态的变化，其含量在正常范围内对于正常的生理功能和骨骼矿化十分重要。此外，血清钙磷水平与骨吸收和骨重建密切相关，两者水平的高低受到多个因子的调控，包括骨碱性磷酸酶、骨钙素、降钙素等[9]。其中，骨碱性磷酸酶是一种水解酶，参与骨骼矿化和形成过程中钙和磷的沉积过程，为机体提供无机磷以合成骨盐结晶，可作为成骨细胞成熟的早期标志之一[10]。骨钙素由成骨细胞产生，其水平升高有利于骨形成，可直接反应骨代谢水平[11]。本研究结果显示，在植入葛根素/β-磷酸三钙支架材料的股骨头坏死大鼠血清中，血钙、血磷水平均上升，同时抑制了骨碱性磷酸酶水平异常增高和骨钙素水平的下降。此外，通过本研究发现，激素性股骨头坏死大鼠经植入葛根素/β-磷酸三钙支架材料后，股骨头组织内Runχ2和VEGF的表达均明显增加。Runχ2是一种骨特异性基质蛋白，可增强成骨细胞相关基因的的转录水平，与骨形成密切相关。而VEGF在骨形成和骨修复过程中同样发挥至关重要的作用，能够与血管内皮细胞上的特异性受体结合，加快细胞增殖、分裂以促进坏死骨组织区域内的血管再生，从而修复坏死骨组织。

综上，葛根素/β-磷酸三钙支架材料可对激素性股骨头坏死大鼠起到较好的修复作用，并具有骨诱导和骨生成特性，从而抑制股骨头坏死的病理进程。本研究为进一步开展临床试验的后续研究提供了参考依据，为临床治疗股骨头坏死奠定了基础。