复方芪参提取物对糖尿病足溃疡模型大鼠创面愈合及HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路的影响

于泽洋，李天博，王江宁

(首都医科大学附属北京世纪坛医院矫形外科，北京 100038)

糖尿病(DM)是全球普遍存在的健康问题。2000年全球约有1.71亿人患有DM，这一数字预计到2030年将增加近一倍[1]。据估计，DM患者中有15%至25%在其一生中会患上足部溃疡，严重影响其生活质量，可能危及生命，这也是大部分糖尿病患者住院的原因。糖尿病足溃疡(DFU)构成严重感染和截肢的重大风险，在发达国家和发展中国家都构成主要的公共卫生负担。与需要截肢的DFU相关的5年死亡率为39%至80%，其已经非常接近最具侵略性的癌症。因此，正在不断研究促进糖尿病足疾病治愈的新方法，以降低发病率和死亡率。局部新血管形成减少和外周血流减少是导致DFU伤口愈合延迟的关键因素。大量证据表明，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)信号的功能受损是与糖尿病相关的血管生成受损的主要机制[2]。HIF-1α是氧稳态的主要调节剂，在正常的氧条件下，HIF-1α迅速羟基化和降解并翻译，这是由HIF脯氨酰羟化酶(PHD)的氧依赖性酶家族介导的[3]。在缺氧的组织条件下，PHD减少了HIF-1α的羟基化作用，其结果是HIF-1α蛋白得以稳定并启动了多个对血管生成至关重要的基因的表达，最显著的是VEGF[4,5]。在糖尿病患者中，HIF-1α的功能活性降低。这种变化导致伤口无法响应软组织缺血而下调VEGF，从而导致血管生成和伤口愈合受损。复方芪参提取物是一种新型的口服活性药物，在贫血中发挥作用的基本机制涉及其介导的HIF-1α的瞬时稳定。此外，复方芪参提取物还具有益气活血，化瘀止痛的功效。目前尚无报道复方芪参提取物在血管生成和糖尿病伤口愈合中的功能。因此，本研究拟探讨复方芪参提取物对糖尿病足溃疡模型大鼠创面愈合及HIF-1α/VEGF/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)通路的影响，为糖尿病足溃疡的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级成年SD大鼠，雌雄各半，7～8周龄，体重200～250g，购自河北省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(冀)2020-0001，动物使用许可证号：SYXK(冀)2020-0003，动物质量合格证号：HBHG2020041603，大鼠饲养环境为：温度(22～26℃)、光照(12h:12h光照/黑暗循环)、湿度60%～70%。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2主要药物、试剂与仪器:复方芪参提取物(原料药，纯度98.5%，河南省新谊药业股份有限公司，批号CSA1019)；盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.85g/片，批号20200109)；高糖高脂饲料(上海帆泊生物技术有限公司，批号K00019)；链脲佐菌素(STZ)(南京沃博生物科技有限公司，批号M5623)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海碧云天生物技术研究所，批号C0904L)；TRIzol试剂(美国Ambion公司，批号WE471-36)；PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司，批号471UY)；SYBR Green I Master Mix荧光定量PCR试剂盒(北京生东科技有限公司，批号A25741)；RIPA裂解缓冲液(美国Sigma-Aldrich公司，批号SA748536)；BCA蛋白质测定试剂盒(美国Thermo Fisher公司，批号KK4156)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(厦门慧嘉生物科技有限公司，批号PPJC0517)；HIF-1α、VEGF、VEGFR2、GAPDH单克隆抗体、羊抗鼠二抗(北京普利莱基因技术有限公司，批号C2168-50、C1782-50、C1779-100、C1319-100、PL10016)；ECL化学发光液(上海李记生物科技有限公司，批号AP34L029)；ImageJ软件(美国国立卫生研究院)；CX21BIM-SET5型显微镜(日本奥林巴斯公司)；StepOnePlus型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；ChemiDoc XRS +型凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)。

1.3造模、分组及给药:71只大鼠适应性喂养1周后进行实验，随机选取12只大鼠作为对照组喂以普通饲料，其它59只大鼠喂以高糖高脂饲料，喂养4周后，对照组大鼠一次性腹腔注射0.1moL/L的柠檬酸钠缓冲液，其它59只大鼠一次性腹腔注射STZ(60mg/kg，溶解在pH 4.5的0.1moL/L柠檬酸钠缓冲液中)，并于72h后检测血糖水平，空腹血糖水平≥16.7mmoL/L的大鼠为糖尿病模型大鼠[6]。59只大鼠成功造模48只，将48只糖尿病模型大鼠按随机数字表法分为模型组、二甲双胍组(0.2g/kg)、复方芪参提取物低剂量组(4g/kg)、复方芪参提取物高剂量组(8g/kg)，每组12只。随后将对照组、模型组、二甲双胍组、复方芪参提取物低剂量组、复方芪参提取物高剂量组大鼠通过腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，在无菌条件下使用5mm皮肤活检打孔器在大鼠背侧后足形成单个圆形全层皮肤溃疡创面伤口，以建立糖尿病足溃疡模型大鼠[7]。造模成功后第1天，二甲双胍组大鼠灌胃0.2g/kg的二甲双胍[8](将二甲双胍在生理盐水中溶解，配制成浓度0.02g/mL的溶液，灌胃体积10mL/kg)；复方芪参提取物低剂量组、复方芪参提取物高剂量组大鼠分别灌胃4g/kg、8g/kg的复方芪参提取物[8](将复方芪参提取物在生理盐水中溶解，配制成浓度分别为0.4g/mL、0.8g/mL的溶液，灌胃体积10mL/kg)；对照组和模型组大鼠灌胃10mL/kg的生理盐水；每天灌胃1次，连续给药4周。

1.4大鼠溃疡创面愈合率的测定:分别于造模完成后和给药结束后对创面照相，并通过ImageJ软件测量创面面积，使用以下公式确定创面愈合情况：创面愈合率=(造模完成后创面面积-给药周期结束后创面面积)/造模完成后创面面积×100%。

1.5糖尿病足大鼠和正常大鼠溃疡创面组织病理观察:腹腔注射4%的水合氯醛麻醉大鼠，分别获取糖尿病足大鼠和正常大鼠溃疡创面组织，常规HE染色，观察大鼠溃疡创面病理情况。

1.6糖尿病足大鼠和正常大鼠溃疡创面组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平测定:取1.5中剩余的创面组织，使用TRIzol试剂提取组织中的总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行逆转录程序合成cDNA，使用实时荧光定量PCR仪和SYBR Green I Master Mix荧光定量PCR试剂盒进行实时PCR，引物由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列如下：HIF-1α正向5'-CTGTGCATGCACAGAAGTGTGTGCTA-3'，HIF-1α反向5'-TGTGACTGACTTGCGCTCGACTGTAG-3'；VEGF正向5'-TGTGACTGACTTGCTGTGTGTCGTA-3'，VEGF反向5'-GTACTACCTGGCTCTGTGTGCGCGT-3'；VEGFR2正向：5'-TGTACGTGAAGCATGCCGTGACCGTA-3'，VEGFR2反向：5'-GGTGACGTGATTTTCTGTTCGTTACAC-3'；β-actin正向：5'-TTGTGACGTGACGCGAGATGTGCGT-3'，β-actin反向：5'-CTGTGCGTGACGTACAGGTTGTGCG-3'。PCR扩增条件如下：95℃持续1min，然后进行40个75℃持续10s和60℃持续20s的循环。并使用2-ΔΔCt方法分析HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平，β-actin作为内参对照。

1.7糖尿病足大鼠和正常大鼠溃疡创面组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平测定:取1.5中剩余的创面组织，在RIPA裂解缓冲液中裂解，使用BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质(30μg)，并转移到PVDF膜上，然后在TBST缓冲液中用5%脱脂奶粉封闭膜2h，并与HIF-1α(1∶1000)、VEGF(1∶1000)、VEGFR2(1∶1500)、GAPDH(1∶1500)一抗孵育过夜，之后与羊抗鼠二抗(1:5000)孵育1h，加入ECL化学发光液，收集蛋白带图像，并用凝胶成像分析系统分析相对光密度。

2 结 果

2.1各组大鼠溃疡创面愈合率比较:与对照组比较，模型组大鼠创面愈合率降低(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组、复方芪参提取物低、高剂量组大鼠创面愈合率升高(P<0.05)，且复方芪参提取物高剂量组大鼠创面愈合率高于复方芪参提取物低剂量组(P<0.05)；与二甲双胍组比较，复方芪参提取物低剂量组大鼠创面愈合率降低(P<0.05)，复方芪参提取物高剂量组大鼠创面愈合率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠溃疡创面愈合率比较

2.2各组大鼠溃疡创面组织病理学比较:对照组创面组织结构正常，可见大量成纤维细胞及毛细血管；模型组创面组织大量炎症细胞浸润，成纤维细胞及毛细血管数目明显减少；二甲双胍和复方芪参提取物干预后，创面组织成纤维细胞及毛细血管增加，炎症细胞浸润减少。见图1。

图1 各组大鼠溃疡创面组织病理图(HE染色，×200)注:A：对照组，B：模型组，C：二甲双胍组，D：复方芪参提取物低剂量组，E：复方芪参提取物高剂量组

2.3各组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平比较:与对照组比较，模型组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍组、复方芪参提取物低、高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平升高(P<0.05)，且复方芪参提取物高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平高于复方芪参提取物低剂量组(P<0.05)；与二甲双胍组比较，复方芪参提取物低剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)，复方芪参提取物高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠溃疡创面组织HIF-1α VEGF VEGFR2 mRNA水平比较

2.4各组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平比较:与对照组比较，模型组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍组、复方芪参提取物低、高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平升高(P<0.05)，且复方芪参提取物高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平高于复方芪参提取物低剂量组(P<0.05)；与二甲双胍组比较，复方芪参提取物低剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)，复方芪参提取物高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

表3 各组大鼠溃疡创面组织HIF-1α VEGF VEGFR2蛋白水平比较

图2 各组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平表达注A：对照组，B：模型组，C：二甲双胍组，D：复方芪参提取物低剂量组，E：复方芪参提取物高剂量组

3 讨 论

糖尿病足溃疡是全世界重要的卫生保健负担。据估计，每年约有912-2610万人患此病。糖尿病足溃疡的中位愈合时间长达12周，与截肢风险高度相关。局部新生血管形成减少和外周血流减少是导致糖尿病患者伤口愈合延迟的关键因素。由于氧气和营养物质的转移不足，广泛的微血管病会延迟细胞浸润、胶原蛋白合成、血管生成、肉芽组织形成和再上皮形成。有研究证实，复方芪参提取物可抑制肝癌进展[9]。复方芪参提取物主要成分为黄酮类、异黄酮类、生物碱、三萜类植物，这些成分对糖尿病伤口愈合的促进作用有广泛的研究[10]。复方芪参提取物作为促进糖尿病伤口愈合的潜在疗法具有多种优势，除其促进血管生成作用外，据报道复方芪参提取物还可以改善表皮干细胞的增殖和运动能力，加速角质形成细胞的再上皮形成，从而促进皮肤伤口的愈合[11]。本研究结果发现：与模型组相比，二甲双胍组、复方芪参提取物低、高剂量组大鼠创面愈合率升高，创面组织成纤维细胞及毛细血管增加，炎症细胞浸润减少。这说明，复方芪参提取物可促进糖尿病足溃疡模型大鼠创面愈合，减轻创面炎症反应，与上述研究结论相符。

糖尿病伤口的延迟愈合特性是由于缺氧导致新生血管形成受损的结果。研究报道了新生血管形成受损的潜在机制是缺氧诱导的VEGF表达降低，这是由于HIF-1α的反式激活所致[12]。这种变化是由于高糖暴露降低了HIF-1α结合其共激活因子p300，主要原因是活性氧簇(ROS)诱导的乙二醛酶1底物(甲基乙二醛)对p300的修饰而引起的。证明高血糖通过干扰HIF-1α的稳定性，从而抑制HIF-1α和其下游基因VEGF的表达。因此，HIF-1α/VEGF信号功能受损被认为是糖尿病足患者血管生成受损和伤口愈合延迟的主要原因[13]。研究证明，HIF-1α的稳定对于逆转这种病理过程至关重要[14]。高压氧(HBO)疗法激活了HIF-1α，其目标基因VEGF和VEGFR2以及局部HIF-1α在糖尿病伤口中的转移与HBO有协同作用。此外，细胞实验表明，二甲基草酰甘氨酸可上调HIF-1α，改善血管生成并显著加速糖尿病创面愈合过程[15]。本研究结果显示，使用二甲双胍和复方芪参提取物治疗后，二甲双胍组、复方芪参提取物低、高剂量组大鼠溃疡创面组织HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白水平高于模型组。这说明，复方芪参提取物促进糖尿病足大鼠溃疡创面组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表达，进而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路，从而促进糖尿病足溃疡模型大鼠创面愈合，与上述研究结果一致。

综上所述，复方芪参提取物可促进糖尿病足溃疡模型大鼠创面愈合，其机制可能与复方芪参提取物促进大鼠糖尿病足溃疡创面组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表达，进而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路有关。