杯苋甾酮通过上调miR-204表达抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的实验研究

杨少辉，许红霞，孙卫强，崔慧君，唐 丽

(山东省文登整骨医院临床药学科，山东 威海 264400)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性、进行性骨关节疾病，多见于中老年人，关节软骨破坏及继发的软骨细胞凋亡是其典型特征[1]。目前对于OA尚无满意的治疗方法，通常针对细胞外基质降解酶，寻找相应的酶活性抑制剂，但会出现不良反应[2]。虽然OA进展缓慢，但患者运动过程中负担很大。长期以来，大型负重关节的疼痛、僵硬会导致严重的残疾，需要进行外科手术治疗，影响生活质量的同时，还往往伴随着巨大的医疗保健成本。研究发现，软骨细胞凋亡是导致关节软骨退变并发展为OA的重要环节，抑制软骨细胞凋亡可能是治疗OA的有效途径[3]。白细胞介素(interleukin，IL)-1β作为一种致炎细胞因子，可诱导软骨细胞凋亡，在OA发生发展中起重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种小分子非编码RNA，能够调节软骨细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为，在OA发生发展过程中起重要作用[5]。有研究发现，miR-204可通过抑制IL-1β的产生参与OA进展[6]。杯苋甾酮是苋科植物川牛膝的主要化学成分，可双向调节破骨和成骨，是一种潜在的骨质疏松治疗药物[7]。本研究将通过探讨杯苋甾酮通过miR-204途径对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响，以期为OA治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器:人正常软骨细胞C28/I2购自美国ATCC细胞库；胎牛血清购自澳大利亚AusGeneX公司；DMEM培养基购自德国merck/sigma公司；重组人IL-1β购自美国santa公司；杯苋甾酮(批号：D0073，HPLC≥98%)购自上海宝曼生物科技有限公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自哈尔滨新海基因检测有限公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒购自美国Promega公司；Lipofectamine 2000转染试剂(货号：11668030)购自美国Life Technologies；NC-siRNA、miR-204 siRNA及miR-204、U6引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、细胞色素C(Cytochrome C)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体、半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗体、GAPDH抗体购自abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(批号：0295G-HRP)购自美国santa公司；恒温培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)，日本松下公司；流式细胞仪(型号：BD FACSCanto II)，美国BD公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)为美国Applied Biosystems公司产品；酶标仪、化学发光成像系统(型号：MODEL550、ChemiDocXRS)，美国Bio-Rad公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:将C28/I2细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合率达到80%左右时，用胰蛋白酶消化、传代培养。取对数期C28/I2细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔培养板，设置①对照组、IL-1β组、低剂量杯苋甾酮组、中剂量杯苋甾酮组和高剂量杯苋甾酮组，对照组不进行处理，IL-1β组加50mg/L IL-1β处理[8]，低剂量杯苋甾酮组、中剂量杯苋甾酮组、高剂量杯苋甾酮组在加50mg/L IL-1β处理的基础上，分别加入杯苋甾酮，终浓度分别为2.5mg/L、5mg/L、10mg/L[7]；②正常对照组、阴性对照组和miR-204 siRNA组。三组均加入50mg/L IL-1β、10mg/L杯苋甾酮处理，其中阴性对照组和miR-204 siRNA组C28/I2细胞使用Lipofectamine2000转染试剂分别转染NC-siRNA、miR-204 siRNA。

1.2.2CCK-8法检测C28/I2细胞增殖情况:将C28/I2细胞培养24h、48h、72h，同时设置仅含培养基的空白组，加入CCK-8试剂后继续培养2h，使用全自动酶标仪于波长450nm处检测各孔吸光度(optical density，OD)值，计算细胞活力，细胞活力=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.2.3流式细胞仪检测C28/I2细胞凋亡情况:将C28/I2细胞培养48h，收集细胞，胰蛋白酶消化，PBS洗涤，使用400μL 1×结合缓冲液调整成细胞浓度为1×106个/mL的细胞悬浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒操作说明书步骤，分别加入Annexin V-FITC、PI各5μL，避光孵育1h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4ELISA法检测C28/I2细胞上清液中炎症因子水平:将C28/I2细胞培养48h，收集各组C28/I2细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪于450nm波长下检测各孔OD值，计算IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.2.5qRT-PCR法检测C28/I2细胞中miR-204表达情况:将C28/I2细胞培养48h，收集细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用qRT-PCR法检测miR-204表达水平，内参基因为U6。反应程序：95℃预变性10min；95℃变性10s，55℃退火35s，72℃延伸1min，循环40次。miR-204上游引物：5'-ACGCGTGTAGTAGCTGCTGAG-3'，下游引物：5'-GCGGUAUCGUAUCGUAUGCUAG-3'；内参U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。Ct值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数，相对表达量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.6蛋白印迹(western blot，WB)法检测C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达情况:将C28/I2细胞培养48 h，收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。电泳分离等量蛋白质并转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h，分别加入Cytochrome C抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、GAPDH抗体(1：500)，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:5000)，室温孵育1h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

2 结 果

2.1各组C28/I2细胞增殖情况:各个时间点，与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞活力显著降低(P<0.05)；与IL-1β组相比，随着杯苋甾酮剂量的升高，C28/I2细胞活力逐次升高。见表1。

表1 各组C28/I2细胞活力比较

2.2各组C28/I2细胞凋亡情况:与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与IL-1β组相比，低、中、高剂量杯苋甾酮组C28/I2细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；随着杯苋甾酮剂量的升高，C28/I2细凋亡率逐次降低(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组C28/I2细胞凋亡情况

表2 各组C28/I2细胞凋亡率比较

2.3各组C28/I2细胞上清液中炎症因子表达水平:与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)；与IL-1β组相比，低、中、高剂量杯苋甾酮组C28/I2细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著降低(P<0.05)；随着杯苋甾酮剂量的升高，C28/I2细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平逐次降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组C28/I2细胞上清液中炎症因子表达水平比较

2.4各组C28/I2细胞中miR-204表达情况:与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞中miR-204表达水平显著降低(P<0.05)；与IL-1β组相比，低、中、高剂量杯苋甾酮组C28/I2细胞中miR-204表达水平显著升高(P<0.05)；随着杯苋甾酮剂量的升高，C28/I2细胞中miR-204表达水平逐次升高(P<0.05)。见图2、表4。

表4 各组C28/I2细胞中miR-204表达水平比较

图2 五组C28/I2细胞中miR-204表达电泳图

2.5各组C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达情况:与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与IL-1β组相比，低、中、高剂量杯苋甾酮组C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；随着杯苋甾酮剂量的升高，C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达水平逐次降低(P<0.05)。见图3、表5。

表5 各组C28/I2细胞中Cytochrome C Bax Caspase-3蛋白表达水平比较

图3 各组C28/I2细胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表达情况

2.6下调miR-204表达对杯苋甾酮抑制C28/I2细胞凋亡的影响:正常对照组与阴性对照组C28/I2细胞中miR-204表达水平、凋亡率的差异无统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组相比，miR-204 siRNA组C28/I2细胞中miR-204表达水平显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05)。见图4、图5、表6。

图4 下调miR-204表达对杯苋甾酮抑制C28/I2细胞凋亡的影响

表6 各组C28/I2细胞中miR-204表达水平及细胞凋亡率比较

图5 三组C28/I2细胞中miR-204表达电泳图

3 讨 论

现有研究已对OA发病机制有一定程度的了解，大量的候选药物也在为用于OA治疗开展相关实验。然而，目前进入临床实验的试验药物都是高特异性的，属于针对某种细胞外基质降解酶的抑制剂，这种治疗手段并不能改善OA的整个疾病进程，治疗效果有限，且部分药物具有副作用[2]。IL是一类调节细胞生长及分化的因子，主要由白细胞分泌，目前已知与软骨损伤有关的IL因子有IL-1β、IL-6、IL-8等[9]。其中，IL-1β是破坏关节软骨最直接的IL细胞因子，其水平与关节软骨退变程度呈正比，能够促进软骨基质的降解，并诱导软骨细胞的凋亡，常用于诱导关节软骨细胞凋亡建立关节炎软骨细胞模型。

IL-6、IL-8、TNF-α是参与炎症反应的常见因子，均参与OA的发生发展过程[10]。本研究结果显示，与对照组相比，IL-1β组C28/I2细胞OD值显著降低，凋亡率显著升高，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著升高，提示IL-1β可以抑制C28/I2细胞增殖，并诱导其凋亡，这可能是通过促进IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子表达，增强炎症反应发挥作用的。miRNA是一种单链小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与对炎症反应的调控。李静等[11]研究表明，miR-204能通过下调NOTCH2减轻心肌缺血再灌注大鼠的心肌炎症反应及氧化应激反应。徐琰瑛等[12]研究表明，miR-204在角膜损伤愈合过程中，不仅与小梁网细胞的凋亡及生存能力有关，还与炎症介质的表达有着重要联系。Song等[6]研究发现，OA软骨组织中miR-204水平明显降低，使用IL-1β处理软骨细胞可降低miR-204水平，而过表达miR-204可抑制软骨细胞中IL-1β蛋白水平，并消除IL-1β对软骨细胞中COX-2、IL-6表达的促进作用。本研究结果亦显示，IL-1β组C28/I2细胞中miR-204表达水平较对照组显著降低，提示IL-1β可抑制C28/I2细胞中miR-204表达。

川牛膝是一种苋科植物，其根干燥后具有祛瘀止痛、活血通经、强筋健骨等功效，常用来治疗骨折及其炎症反应[13]。杯苋甾酮是川牛膝的主要化学成分，在治疗骨质疏松症时具有抑制破骨分化和促进成骨分化的双向作用，在骨折修复中有助于加快骨折愈合并缩短骨折愈合时间[14]。本研究发现，与IL-1β组相比，杯苋甾酮组C28/I2细胞OD值及miR-204表达水平显著升高，细胞凋亡率及上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著降低，提示使用杯苋甾酮可以促进miR-204表达，降低炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达，促进C28/I2细胞增殖并减少其凋亡。进一步研究显示，在使用IL-1β、杯苋甾酮处理C28/I2细胞基础上，下调miR-204表达可导致细胞凋亡率升高，提示miR-204表达水平与C28/I2细胞凋亡过程有关，杯苋甾酮减少C28/I2细胞凋亡可能是通过上调miR-204表达发挥作用的，并进一步推测杯苋甾酮通过上调miR-204表达，消除IL-1β引起的炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平变化，进而影响C28/I2细胞的增殖、凋亡，但miR-204影响炎症因子变化的途径还有待深入研究[6]。

CytochromeC是重要的凋亡激活因子，当细胞受到病理因素刺激后，从线粒体释放至细胞质中，激活细胞质中的凋亡反应，诱导细胞凋亡发生。有研究发现，IL-1β可以促进CytochromeC释放，经由线粒体途径诱导关节软骨细胞的凋亡[15]。Bax、Caspase-3分别为Bcl-2家族、caspase家族的重要成员，参与细胞凋亡。本研究结果显示，IL-1β促进C28/I2细胞凋亡及杯苋甾酮通过促进miR-204表达发挥抑制IL-1β对C28/I2细胞的促凋亡作用过程中，CytochromeC、Bax、Caspase-3蛋白水平均有显著变化，表明杯苋甾酮促进miR-204表达后，减轻IL-1β引起的炎症反应，并可能通过调控CytochromeC释放，进而减少促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达，从而抑制C28/I2细胞凋亡。

综上所述，杯苋甾酮可能通过上调miR-204表达，进而抑制IL-1β诱导的软骨细胞C28/I2凋亡。这可能为骨关节炎症的治疗提供了一定参考，但miRNA调控机制复杂，下一步研究将更深入明确其具体调控机制。