自建MALDI-TOF MS霉菌数据库的研究*

李艳君，孙钊坤，丁赔赔，王姣贤，董 蓉，赵强元

解放军总医院第六医学中心检验科，北京 100048

近年来，随着肿瘤、艾滋病等免疫受损患者的增多，免疫抑制剂及广谱抗菌药物的长期使用，以及介入治疗手段的开展，真菌感染发病率呈上升趋势，尤其是侵袭性真菌感染，是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-3]。真菌感染病原的快速鉴定对于临床及时实施抗真菌目标治疗、降低患者病死率至关重要。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)突破传统方法的鉴定耗时长、鉴定能力不足等弊端，在临床得到广泛应用[4-6]。但对于真菌中的霉菌而言，MALDI-TOF MS存在鉴定能力不足的问题[7-8]，其原因之一是霉菌菌丝结构细胞壁较厚，导致菌体蛋白释放不充分，而更主要的原因是仪器商品化的霉菌数据库包含的菌种资源较少，缺少可供鉴定的比对数据。本研究通过收集临床来源的各类霉菌，建立本地化MALDI-TOF MS霉菌数据库，目的在于提高霉菌的鉴定能力，从而为临床霉菌感染病原的快速检测和患者的及时治疗提供帮助。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 266株临床霉菌分离自2018年1月至2019年4月本院临床送检的各类标本，包括痰液、肺泡灌洗液、脓液、组织标本等，所有标本以三区划线方式接种至沙保罗培养基，28 ℃培养48 h左右，挑取肉眼可见的单个菌落，以点种方式接种至沙保罗培养基进行纯培养，28 ℃培养48 h后每日观察菌落生长状况，根据不同种类丝状真菌生长速度不同，适当延长培养时间，以菌落直径达到1.5 cm时结束培养，进行后续试验。

1.2仪器与试剂 德国Bruker公司的Microflex系列MALDI-TOF质谱仪及配套分析软件FlexControl 3.4和Biotyper 3.1；美国ABI梯度PCR仪；上海一恒MJ-Ⅱ霉菌培养箱；质谱仪配套甲酸及基质液；日本Sigma公司真菌DNA提取试剂盒、PCR反应试剂；法国梅里埃沙保罗真菌培养基。

1.3方法

1.3.1基于18S rDNA 测序的菌种鉴定 纯培养菌落用异丙醇沉淀法提取基因组DNA，扩增引物序列为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应体系为30.0 μL(DNA模板1.0 μL，上下游引物各3.0 μL，缓冲液 3.0 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.2 μL，水17.8 μL)；扩增条件为95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35循环，72 ℃ 10 min。扩增产物上机测序，序列结果登录美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站进行比对，明确菌种。

1.3.2采集蛋白谱图 纯培养霉菌菌落应用甲酸萃取法提取蛋白，吸取1 μL上清液，滴加到MALDI靶板上，每株菌制备到8个靶位，晾干后滴加 HCCA基质溶液，干燥后上机检测。打开FlexControl 3.4软件采集谱峰：每个靶位采图3张，每张图轰击100次激光，将获得的24张图谱在Flexanalysis中打开，除去低质量的图谱。将>20张的有效图谱在Biotyper 3.1中打开，若<20张有效图谱则重复试验，按照18S rDNA测序鉴定结果输入菌株名称，指定路径和目录完成建库过程。

1.3.3数据库的验证 56株霉菌分别用商品化数据库、自建数据库和扩展数据库(商品化数据库+自建数据库)进行菌种鉴定，与18S rDNA扩增测序鉴定结果进行比较，结果一致为鉴定正确，否则为鉴定错误。并记录鉴定分值，根据仪器提供的分值判断：>2.0分为可信的菌种水平鉴定；1.7～2.0分为可能的菌种水平鉴定；<1.7分为不可靠的鉴定。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理，应用MALDI-TOF MS配套的FlexControl软件收集蛋白谱图，采用Biotyper软件构建评价数据库。计数资料以例数或构成比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1自建数据库霉菌菌种信息及质谱图容量 210株霉菌经18S rDNA 扩增测序后，6株出现双峰或测序失败，故204株霉菌用于数据库的构建。自建霉菌数据库中共包含19个菌属，67个菌种，204株临床常见霉菌的质谱图及菌株详细信息见表1。曲霉属在数据库中占比最高(33.8%)，共69株，包含15个常见菌种，其中7种为商品化数据库未包含的菌种。除商品化数据库和自建数据库中共有的菌种以外，加入自建数据库后，目前扩展数据库共包括53个菌属，169个菌种，569株霉菌的质谱图，与原商品化数据库比较，增加了10个菌属，42个菌种，共204个质谱图，包括篮状菌、小穴壳菌属、双膜菌、亚隔孢壳属、外瓶霉、耙齿菌、派伦霉属、棘壳孢、丝孢菌和子囊菌属。见表2。

表1 自建霉菌数据库的菌种信息

续表1 自建霉菌数据库的菌种信息

表2 各数据库霉菌质谱图容量比较(n)

2.2数据库验证

2.2.1验证菌株 选取临床霉菌分离株56株，经18S rDNA扩增测序后明确菌种，包含12个菌属，29个菌种，各菌种株数及鉴定结果见表3。

表3 56株用于数据库验证的菌株信息

2.2.2数据库鉴定结果 4株杂色曲霉有1株鉴定错误，其余3株的鉴定分值<1.7分。鉴定正确株数、正确率及鉴定分值分布数据见表4。商品化数据库与扩展数据库的鉴定正确率经χ2检验，差异有统计学意义(χ2=58.35，P<0.05)。

表4 数据库鉴定结果

3 讨 论

霉菌是真菌中的一大类，在临床上可引起各类侵袭性感染，以呼吸系统感染最为多见[9]。感染者多为免疫受损或接受各种侵入性操作的患者，临床治疗困难，病死率较高[8]。病原的快速诊断对于抢先治疗、提高治愈率至关重要。目前，对于霉菌的鉴定通常采用形态学方法，而霉菌体外培养生长缓慢，形态学鉴定对于检验人员技术能力要求较高，所以需要开发更加快速准确的检验技术以适应临床需要。

近年来，MALDI-TOF MS被越来越广泛地应用于临床各类病原鉴定，但对于霉菌而言，仍存在鉴定能力不足的问题，其主要局限于商品化数据库的菌株信息有限。有研究报道，通过增加数据库容量，能够提高对霉菌的鉴定能力[3,10-14]。本研究通过收集临床菌株进行了自建本地化霉菌数据库的研究。

首先，自建霉菌数据库大大丰富了原商品化数据库的霉菌种类和数量。本研究自建数据库共包含19个菌属，67个菌种，204株霉菌质谱图，与商品化数据库比较，自建数据库新增了10个菌属，42个菌种，204株霉菌的质谱图。自建数据库与商品化数据库合并后形成的扩展数据库共包括53个菌属，169个菌种，569株霉菌的质谱图，不仅丰富了商品化数据库菌株的数量和种类，商品化数据库部分菌株来源于环境或工业标准菌株，而自建数据库中的菌株均来源于临床标本，能够更加贴近临床菌株的鉴定需求。如曲霉菌是临床感染常见的霉菌种类，本研究中新增曲霉菌69株，其中7种为商品化数据库中未包含的菌种。

其次，通过对数据库鉴定能力的验证可评价自建数据库用于临床常见霉菌鉴定的准确性。随机选取56株临床来源霉菌，分别用自建数据库、商品化数据库和扩展数据库进行菌种鉴定，与18S rDNA扩增测序的鉴定结果进行比较，计算各数据库的鉴定正确率。通过数据分析，商品化数据库鉴定的正确率仅为32.1%，而且从鉴定分值来看，>2.0分的只有2株，<1.7分的有6株，虽然这6株霉菌鉴定结果正确，但在实际工作中按照判断标准，<1.7分的鉴定结果是不可信的，因此，应用商品化数据库进行56株霉菌的鉴定，只有12株霉菌得到可信的正确鉴定结果。自建数据库的鉴定正确率达到87.5%，46株霉菌得到可信的正确鉴定结果。扩展数据库的鉴定正确率高达91.1%，48株霉菌得到可信的正确鉴定结果。对商品化数据库和扩展数据库鉴定正确率进行χ2检验，差异有统计学意义(χ2=58.35，P<0.05)，说明加入了自建数据库的霉菌质谱图后，明显提高了MALDI-TOF MS对临床常见霉菌的菌种鉴定能力。

本研究发现，霉菌鉴定即便在一定程度上通过自建数据库提高了其鉴定能力，与细菌鉴定比较，仍存在一定的局限性，主要是因为霉菌的菌丝及分生孢子等特殊结构的细胞壁较厚，常规的前处理方法难以重复裂解细胞壁，释放菌体蛋白，导致鉴定分值较低，如临床常见的杂色曲霉，尽管商品化数据库中存在10株杂色曲霉的质谱图，本研究中的4株杂色曲霉有1株鉴定错误，其余3株的鉴定分值<1.7分。另有研究报道，霉菌的培养条件与MALDI-TOF MS鉴定能力也存在一定相关性，28 ℃培养温度下的鉴定率高于35 ℃培养温度，培养第2、3天种水平和属水平鉴定率均较高，但沙保罗和土豆葡萄糖琼脂两种培养基间的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05)[15]。所以，通过建立基于临床来源菌株的霉菌数据库，摸索适宜的菌株前处理方法，有助于充分发挥MALDI-TOF MS鉴定高通量、速度快、操作简便等优势，提高临床各类感染来源霉菌的鉴定能力。

综上所述，本研究通过收集临床菌株建立本地化的MALDI-TOF MS霉菌数据库，大大丰富了商品化数据库菌株的种类和数量，经验证，扩展数据库明显提高了临床菌株的鉴定能力。在今后的临床工作中，应不断添加新菌种，优化菌株前处理条件，为临床侵袭性感染霉菌的快速准确鉴定提供有力支持。