羊栖菜多糖对3T3-L1 脂肪细胞脂代谢的影响及其机制

张杰，杨旭东★，石杰，杨骄霞，王桂云，宋高臣

（1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011）

0 引言

羊栖菜是一种隶属于褐藻门的食用海藻，富含氨基酸、维生素和多糖等，其重要成分羊栖菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）是一种具有多种生物活性的物质，具有抗氧化、抗衰老、抑制肿瘤、降血脂等作用[1-3]。本课题组前期动物实验发现，SFPS 具有改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用[4-5]，但其对体外脂肪细胞的增殖及糖脂代谢的影响及其机制未见报道。本实验进一步观察羊栖菜多糖对3T3-L1 脂肪细胞脂代谢的影响并初步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

羊栖菜多糖由牡丹江医学院中心实验室提供；3T3-L1 前脂肪细胞（美国ATCC 公司）；DMEM 高糖培养液、胎牛血清（美国Gibco 公司）；DOMO、MTT试剂（Sigma 公司）；胰蛋白酶、引物核苷酸片段（上海生工），其他试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器和设备

CO2恒温培养箱（美国G.S.公司）；PCR 仪（德国，Biometra）；紫外分光光度计（上海元析）；酶标仪（美国Biotek公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；PCR 仪（德国，Biometra）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

3T3-L1 前脂肪细胞培养条件[6]，37℃饱和湿度，5%CO2环境，10%胎牛血清DMEM 高糖培养液（链霉素100mg/L、青霉素100IU/L）培养。

1.3.2 胰岛素抵抗模型建立

待分化细胞37℃饱和湿度，5%CO2培养箱，DMEM培养基中加入诱导液1（10µg/mL 胰岛素、0.5mmol/LIBMX、1mmol/mL 地塞米松）培养2d。弃上清，DMEM培养基中加入诱导液2（10mg/L 胰岛素），培养2d。更换DMEM 培养基，37℃，5%CO2培养箱，培养9d，细胞接近圆形，脂滴明显聚集，细胞分化完成。分化成熟的3T3-L1 脂肪细胞分为对照组（高糖DMEM 培养基）和模型组（1mmol/mL 地塞米松），96h 后，GOD-POD方法测定培养基中葡萄糖消耗量确定模型是否成功。

1.3.3 胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量、甘油三酯和游离脂肪酸的测定

造模成功细胞分为3 组：模型组、SFPS 100mg/L 组 和SFPS 200mg/L 组，另 设 分 化 成 熟3T3-L1 脂肪细胞为正常对照组。上述各组继续培养48h 后，按照试剂盒说明测定葡萄糖消耗量（glucose consumption，Glu）、游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）的生成量和细胞中甘油三酯（triglyceride,TG）含量。

1.3.4 MTT 法检测细胞相对增殖率

正常对照组、模型组、SFPS 100mg/L 组和SFPS 200mg/L 组细胞，每组6 个平行孔，分别培养24h、48h、72h，加入MTT（5g/L）20μL，孵育4h，弃上清，加150μL DMSO，完全溶解，轻微振荡12min。酶标仪570nm 测光密度（OD）值，并计算细胞相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR）。RGR（细胞相对增殖率）＝实验组OD 值／对照组OD 值×100%

1.3.5 RT-PCR 检测3T3-L1 细胞中GLUT-4、HSL的mRNA 表达情况

各组细胞弃培养液，Trizol 法提取3T3-L1 细胞细胞总RNA，鉴定RNA 纯度后逆转录生成cDNA。PCR 反应条件：预变性95℃60s，变性95℃15s，复性60℃25s，延伸72℃45s，共40 个循环，引物序列，见表1。凝胶成像系统分析，分别计算GLUT-4/β-actin 和HSL/β-actin 的灰度比值。

表1 GLUT-4、HSL 的引物序列

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 SFPS 对3T3-L1 细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响

造模细胞分别培养24h、48h、72h，与对照组比较，培养48h、72h 的模型组细胞培养基中葡萄糖浓度显著升高(P＜0.01)，表明细胞对葡萄糖的消耗量显著降低，见表2。

表2 3T3-L1 细胞培养基中葡萄糖浓度（，n=6，mmol/L）

表2 3T3-L1 细胞培养基中葡萄糖浓度（，n=6，mmol/L）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 SFPS 对胰岛素抵抗3T3-L1 细胞糖脂代谢的影响

由表3 可知，与模型组比较，SFPS 100mg/L 组和SFPS 200mg/L 组也能显著增加胰岛素抵抗3T3-L1细胞葡萄糖消耗量的量 (P＜0.01)。与模型组比较，SFPS 100mg/L 组和SFPS 200mg/L 组也显著降低胰岛素抵抗3T3-L1 细胞生成FFA 的量(P＜0.01)。

表3 SFPS 对胰岛素抵抗3T3-L1 细胞中糖脂代谢的影响（，n=6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

2.3 SFPS 对胰岛素抵抗3T3-L1 细胞相对增殖率的影响

与正常对照组比较，模型组胰岛素抵抗3T3-L1细胞24h，48h 和72h 相对增值率降低（P＜0.01，P＜0.05），24h，48h 细胞相对增殖率降低显著（P＜0.01）。与模型组比较，SFPS 100mg/L 组和SFPS 200mg/L 组能提高胰岛素抵抗3T3-L1 细胞相对增值率，提高细胞活力，24h 细胞和48h 细胞相对增值率显著增加（P＜0.01），见表4。

2.4 SFPS 对3T3-L1 细胞中GLUT-4、HSL mRNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组胰岛素抵抗3T3-L1 细胞GLUT-4 mRNA 表达显著降低，HSL mRNA 表达显著增加（P＜0.01）（见表5，图1、2）。与模型组比较，SFPS 100mg/L 组和SFPS 200mg/L 组GLUT-4mRNA 表达显著增加，HSL mRNA 表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05）（见表5，图1、2）。

表4 SFPS 对胰岛素抵抗3T3-L1 细胞相对增殖率的影响（,n=6）

表4 SFPS 对胰岛素抵抗3T3-L1 细胞相对增殖率的影响（,n=6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01，* P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

表5 SFPS 对3T3-L1 细胞中GLUT-4、HSL mRNA 表达的影响（，n=6）

表5 SFPS 对3T3-L1 细胞中GLUT-4、HSL mRNA 表达的影响（，n=6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01，* P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

图1 各组细胞GLUT-4 基因表达

图2 各组细胞HSL 基因表达

3 讨论

2 型糖尿病是一种复杂糖脂代谢紊乱的慢性疾病，以糖耐量异常、脂质代谢异常为特征的胰岛素抵抗贯穿于2 型糖尿病的始终。胰岛素抵抗是指各种原因引起的外周组织对胰岛素的敏感性降低，利用葡萄糖不足[7]，主要累及肝脏、脂肪、肌肉等组织，其中脂肪组织分泌的脂肪因子在机制中占重要地位[8-9]。SFPS 是羊栖菜中的多糖成分，具有抗菌、增强免疫力，调节脂代谢等作用[10-11]，因此，本实验进一步研究SFPS 对3T3-L1 细胞胰岛素抵抗的作用并初步探讨其作用机制。

葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）是组织细胞利用调节葡萄糖的重要蛋白，家族重要成员GLUT4 在脂肪、肝脏等组织中均有表达，GLUT4 蛋白将细胞外葡萄糖转运到细胞内[12-13]，对胰岛素反应敏感。已有研究显示，胰岛素抵抗的脂肪细胞膜上GLUT4 表达减少，与胰岛素抵抗密切相关[14-15]。为了研究SFPS 对3T3-L1 细胞胰岛素抵抗的影响，造模成功的细胞培养液中加入不同浓度的SFPS。本研究中，与模型组比较，SFPS 100 和200 mg/L 组细胞中GLUT4mRNA 的表达量显著增加，表明SFPS 可通过增加GLUT4mRNA 的表达，改善3T3-L1 中胰岛素抵抗。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)是脂肪分解的限速酶之一，在脂肪组织中受多种激素的调控，主要催化甘油三脂分解为甘油和脂肪酸[16]。为了研究SFPS对3T3-L1 细胞中甘油三酯分解利用的影响，造模成功的细胞培养液中加入不同浓度的SFPS。本研究中，与模型组比较，SFPS 100 和200 mg/L 组细胞中HSL mRNA 的表达量显著降低，表明SFPS 可通过降低HSL mRNA 的表达，抑制3T3-L1 中脂质的分解利用。

本研究结果显示：①SFPS 能显著增加胰岛素抵抗3T3-L1 细胞葡萄糖消耗量，显著降低胰岛素抵抗3T3-L1 细胞生成FFA 的量。②SFPS 能显著增加GLUT-4 mRNA 的表达，显著降低HSL mRNA 的表达。实验结果提示，SFPS 改善3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制可能与调控GLUT-4 和HSL mRNA 的表达有关。