萝卜硫素通过lncRNA MALAT1/TFEB信号通路诱导人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡机制探讨

刘彩玉 杨丽亚 田冬梅

[关键词]萝卜硫素;人皮肤鳞状细胞癌;凋亡;增殖;lncRNA MALAT1/TFEB信号通路;机制

皮肤鳞状细胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SSCC）是最常见的皮肤癌，仅次于基底细胞癌，占全球已知皮肤癌的20%～50%[1]。手术治疗只对早期或已确诊的SSCC患者有效，而对伴发其他疾病和使用免疫抑制剂或抗凝剂的老年患者不适合手术治疗，还会对患者外貌带来不良影响[2-3]。因此，寻找高效、低副作用的新型抗肿瘤药物迫在眉睫。萝卜硫素抗肿瘤活性的研究更加受到重视，并且其还具有防治皮肤癌和光防护作用，主要包括预防皮肤炎症、红斑、皮肤上皮细胞氧化应激损伤、光老化及皮肤肿瘤等[4]，其中对黑素瘤细胞增殖具有明显的抑制作用[5]。然而，关于萝卜硫素对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的药理抑制作用研究甚少，于是本文探讨了萝卜硫素对A431细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料：人皮膚鳞状细胞癌A431细胞株（上海ATCC细胞库）;DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK-8试剂盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）;Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒（北京四正柏生物公司）;Caspase-3/9活性检测试剂盒（Solarbio公司）;兔抗鼠t-PARP、cle-PARP、cle-Caspase-3、TFEB、TFEB（Ser142）及β-actin抗体（美国CST公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化学发光检测试剂盒（Advansta）。

1.2 主要仪器：BIORAD-550型酶标仪（美国伯乐公司）;BBS-V800型单人超净台（山东鑫贝西公司）;SPX-250型细胞培养箱（美国Thermo公司）;GE-100型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）;Amersham Imager 600仪器（BIORAD，美国）;FACSCalibur型流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。

1.3 A431细胞培养：采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM培养基对A431细胞进行培养，培养箱条件设置为5%CO2、37℃恒温。待细胞融合至90%左右时，便进行传代培养。首先PBS清洗细胞2遍，加入胰蛋白酶进行消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化，转移至Ep离心管，1 000rpm离心5min，弃去旧培养液，加入新鲜培养液重悬细胞进行后续实验。

1.4 CCK-8实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞24、48、72、96h后，弃去旧培养液，每孔加入100μl含10μl的CCK-8试剂的DMEM培养液，放入培养箱中继续孵育1.5h，在酶标仪450nm波长处检测细胞吸光度OD值，并计算细胞相对活力。计算公式如下：细胞相对活力（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.5 细胞克隆数分析：将对数期A431细胞接种于6孔板，每孔1 000个细胞，培养过夜，然后加入5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞6d后，每2d更换一次含药的新鲜培养液;然后对克隆细胞进行染色并计数。

1.6 BrdU ELISA实验：将对数期A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜;5～40μg/ml的萝卜硫素处理细胞48h后，加入BrdU试剂孵育12h;再采用ELISA试剂盒检测BrdU偶联的细胞，并在酶标仪450nm处测定其吸光度OD值。

1.7 流式细胞术：收集各组细胞，PBS清洗2次，采用2.0mg/ml的PI染液和RNase I染色30min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 RT-PCR实验： 收集各组细胞， PBS清洗2次， 用T R I z o l 试剂提取总R N A ， 采用1 m g 的R N A 、随机引物和AffinityScript QPCR cDNA合成试剂逆转录合成cDNA。再利用iQ5实时PCR仪扩增lncRNA MALAT1基因产物，引物序列如下：正向5‘-AGGCGTTGTG-CGTAGAGGA-3，反向5‘-GGATTTTTACCAA-CCACTCGC-3。

1.9 Western blot实验：收集各组细胞，每组加入200μl的裂解液，置于冰上充分裂解30min，收集细胞裂解液，4℃条件下离心12 000rpm，收集上清。BCA法检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40μg进行电泳分离，恒压70V，电泳3h。然后在恒流275mA条件下电转70min，5%脱脂牛奶封闭1h后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1 ： 1 000）中，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，再把条带放入盛二抗（稀释比1：3 000）的平皿中室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。加入4ml的ECL显影液显色3min，凝胶成像系统曝光。

1.10 Caspase活性试验：收集各组细胞，采用Caspaseglot-3/-9活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性，酶标仪在405nm处测定其吸光度值。

1.11 lncRNA MALAT1质粒转染：ANXA3 mimics质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成，采用Lipofectamine 2 000试剂转染质粒至A431细胞，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.12 统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，两两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异具有统计学意义。