CDPK20基因表达及其对山药块茎膨大调控作用研究

王金鑫，季 祥，高圆丽，张艳芳，邵 盈，邢丽南，霍秀文

(内蒙古农业大学 园艺与植保学院， 呼和浩特010019)

山药(DioscoreaoppositaThunb.)是薯蓣属植物地下块茎的俗称，别名薯蓣、白苕等。山药块茎利用价值很高，既可以当中药来用，也可以作为蔬菜被人们食用，是世界上重要的十大食用块茎植物之一[1]。块茎作为山药的主要产品器官，其生长发育过程较为复杂，涉及各种物质成分的积累以及相关酶活性变化[2]。因此，在相关代谢酶活性以及块茎膨大相关基因方面做进一步的深入研究,可以为山药块茎品质的提高和育种提供理论依据。

钙作为植物的基本元素之一，既可稳定细胞膜结构，维持细胞壁结构，还可以中和植物代谢中产生的酸。在植物中有3种蛋白质可以与钙离子(Ca2+)特异性结合并进行信号转导。它们是钙调蛋白(calmodulin,CaM)、类钙调神经磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like,CBL)和钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)，其中，CDPK与Ca2+结合后，直接将Ca2+信号转换为磷酸化信号，将Ca2+信号传递并放大，促进植物产生响应蛋白[3-5]。研究表明CDPKs存在复杂的调控模式，在植物生长发育及胁迫响应中均扮演重要角色。田晓涵等[6]在对陆地棉的研究中发现，通过诱导过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。ABA是一种重要的逆境激素,CDPKs参与了由ABA调节的植物对干旱和盐胁迫的响应过程。有研究表明ABA可以通过某种途径活化 CDPK1和CDPK1a等蛋白激酶，诱导ABA响应基因的表达[7]。徐梦军等[8]对小麦研究发现TaCPK34表达量与籽粒淀粉积累速率呈显著正相关，推测该激酶参与小麦籽粒淀粉合成的调控，这是首次有关该激酶参与作物淀粉合成的报道。目前钙依赖性蛋白激酶在山药生长发育方面的研究较少，所以本研究通过测定山药块茎淀粉、糖、内源激素等含量、CDPK酶活性，克隆编码钙依赖性蛋白激酶基因的开放阅读框(ORF)，对其进行生物信息学分析、亚细胞定位，比较‘毕克齐’和‘大和长芋’山药的CDPK酶活性及CDPK20在不同时期的差异表达，从而探究其在山药块茎膨大过程中对淀粉糖代谢及内源激素方面的作用，为山药分子育种奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以内蒙古山药块茎形态差异明显的毕克齐山药(B1)和大和长芋山药(DHCY)为试验材料，于2019年4月初种植于内蒙古农业大学山药种质资源研究圃，取样时期为种植后的105 d(T1)、120 d(T2)、135 d(T3)、150 d(T4)和165 d(T5)，挖取长势均匀的块茎，每个时期取3株作为一个生物学重复，共3次重复，用于生理指标的测定。每株每次称取1 g块茎，3株混样，用锡纸包好标记，液氮速冻，-80 ℃冰箱中保存，用于基因克隆及表达分析。

1.2 方 法

1.2.1 生理指标的测定参考本课题组敖兰吉亚[9]的方法，对5个取样时期块茎的淀粉、可溶性糖及还原糖含量进行测定，内源激素ABA、GA3、IAA和ZR的含量测定采用酶联免疫吸附法，每个样品测定3次，取平均值。所用试剂盒由中国农业大学农学与生物技术学院提供，CDPK活性测定试剂盒由江苏酶标生物科技公司提供，每个样品测定3次，取平均值。

1.2.2 山药块茎总RNA的提取及cDNA合成采用RNA提取试剂盒(TaKaRa Mini Best Plant RNA Extraction Kit)提取不同发育时期块茎的总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，用TaKaRa公司的(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA SynthesisKit)试剂盒反转录成单链cDNA。

1.2.3CDPK20的ORF的克隆从本实验室前期通过高通量测序完成的山药块茎转录组数据中，得到钙依赖性蛋白激酶基因(CDPK20,Unigene 0032301)序列。通过Primer Premier 5.0软件在CDPK20的ORF两端设计特异引物进行PCR扩增。反应体系为Extaq 25 μL,CDPK20-ORF-F和CDPK20-ORF-R (10 μmol·L-1) 各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，30 个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物取10 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。并将PCR产物回收纯化，连接到T载体上克隆并测序。

1.2.4 生物信息学分析运用NCBI中的ORF finder查找CDPK20的开放阅读框；在蛋白质生物信息学网站Expasy(https://web.expasy.org)进行蛋白质的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构和二级结构的预测分析。运用NCBI中的Blast进行氨基酸序列同源性搜索，运用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对分析，MEGA 5.0软件构建系统进化树。

1.2.5 亚细胞定位设计含有BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位点的引物(表1)，进行ORF的PCR扩增。反应体系为Extaq 25 μL，CDPK20-SF和CDPK20-SR(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补足至50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸10 min。将产物扩增后回收纯化并连接到T载体上，转化TOP 10感受态细胞，进行菌液阳性克隆PCR快速鉴定。将鉴定后得到的菌落接种到LB(含有浓度为100 μg·mL-1的Amp)液体培养基上，摇床振荡培养，使用TIANGEN公司的质粒提取试剂盒提取质粒。使用内切酶BamH Ⅰ和KpnⅠ对质粒进行双酶切并回收。最后将酶切后的CDPK20编码序列与载体质粒的回收产物使用T4DNA 连接酶连接，完成表达载体的构建。将构建好的载体转入感受态细胞Trans T1中，涂板挑选单克隆，经菌液PCR阳性克隆检测后送南京金斯瑞生物工程有限公司测序验证。将重组质粒以及空载质粒用烟草瞬时转化法转入烟草中，激光共聚焦显微镜观察CDPK20定位。

表1 CDPK20相关的引物序列

1.2.6CDPK20的表达分析使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)试剂盒进行CDPK20基因的qRT-PCR分析。反应体系为：cDNA 2 μL(200 ng·μL-1)，CDPK-qF和CDPK-qR各1 μL(10 μmol·L-1)，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 25 μL，ddH2O 21 μL。反应程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环；溶解曲线：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；每个样品3次重复。利用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

1.3 数据分析

用Excel 2007进行数据分析并制图，采用SPSS 25.0软件进行方差分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 山药块茎膨大过程中生理指标分析

在山药块茎膨大过程中，淀粉含量呈现出先升后降的趋势，在T2～T3二者淀粉含量显著升高，在T3时二者淀粉含量存在显著性差异(图1，A)；可溶性总糖含量二者的变化趋势一致，均表现出先降后升趋势，且在T1～T2显著下降，可溶性总糖含量DHCY在各个取样点均高于B1(图1，B)；还原糖含量二者均表现出先降后升趋势，T2时二者的还原糖含量存在显著差异(图1，C)；CDPK活性均呈现出先升高后降低的趋势，在T4时 B1和DHCY酶活性达到最高峰，分别为72.80 mg·g-1·h-1和77.49 mg·g-1·h-1(图1，D)。

在B1和DHCY中内源激素GA3变化趋势不相同，在B1中呈“升-降-升-降”双峰变化趋势，且在T2时显著高于其他时期；而DHCY呈相反的“降-升-降-升”变化趋势，在T3和T5时显著高于其他时期(图1，E)。B1和DHCY中内源激素IAA呈相一致的先升后降变化趋势，DHCY始终高于B1，且在T1～T3、T5时DHCY显著高于B1(图1，F)。内源激素ABA含量二者变化趋势相同，B1的内源激素ABA含量高于DHCY，且在T1、T2、T3和T5二者差异性显著(图1，G)。内源激素ZR整体呈先升后降的趋势，且在T2和T4时，B1显著高于DHCY(图1，H)。

B1. 毕克齐；DHCY. 大和长芋；T1、T2、T3、T4、T5.分别为种植后的105 d、120 d、135 d、150 d、165 d；不同小写字母表示在0.05不同品种及不同时期水平显著差异。下同

2.2 CDPK20基因的克隆

以山药块茎cDNA为模板，CDPK20-ORF-F和CDPK20-ORF-R为引物进行PCR扩增，获得大小约为1 000 bp的明亮目的条带(图2)，回收该克隆条带连接T载体挑取阳性克隆后测序，测序结果表明该片段实际大小为1 149 bp，用 ORF Finder分析表明CDPK20基因的ORF片段为1 047 bp，共编码348个氨基酸(图3)。

M. DL2000；1. PCR产物

图3 山药块茎CDPK20 的ORF序列及其推导的氨基酸序列Fig.3 The ORF sequence of yam tuber CDPK20 and its deduced amino acid sequence

2.3 生物信息学分析

对山药CDPK20蛋白理化性质分析发现，其分子式为C1775H2782N474O515S14，理论等电点为5.58，为酸性。预测为非跨膜、亲水蛋白；主要由α-螺旋结构和无规则卷曲结构构成。通过DNAMAN软件进行多个物种CDPK20氨基酸序列比对发现，山药CDPK20氨基酸序列与芦笋、菠萝、铁皮石斛、椰子、油棕、海枣、睡莲、小兰屿蝴蝶兰、高粱序列相似性较高,分别为86%、85%、85%、85%、85%、84%、84%、84%和81%(图4)。利用MEGA 5.0软件将山药CDPK20蛋白其他9种植物的同源蛋白进行系统进化树构建，结果表明山药与铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰之间的亲缘关系最近(图5)。

图5 山药块茎CDPK20的系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree of CDPK20 of yam

XP_020092263.1. 菠萝；XP_002463047.1. 高粱；XP_008810968.1. 海枣；XP_020257982.1. 芦笋；XP_031488036.1. 睡莲；XP_020682170.1. 铁皮石斛；XP_020574779.1. 小兰屿蝴蝶兰；EHA8588299.1. 椰子；XP_010923436.1. 油棕

2.4 CDPK20的亚细胞定位

将检测成功的农杆菌菌液转入烟草叶片中,黑暗中培养过夜后,置于激光共聚焦显微镜下观察。

GFP-CK为对照，GFP荧光信号均匀分布于烟草细胞内部,发现CDPK20-GFP荧光信号在细胞核和细胞膜中较强(图6)。

GFP. 绿色荧光蛋白； DAPI. 细胞核染色； DIC. 明场；Merge. 叠加场； 标尺=40 μm

2.5 山药不同时期CDPK20基因表达分析

qRT-PCR结果表明，B1和DHCY在整个膨大期均呈现出先升高后降低的趋势；且二者均在T1～T2表达量显著升高；在T4时二者存在显著差异并且表达量达最高值,B1高出DHCY 2.14倍(图7)。

图7 山药块茎生长发育过程中CDPK20相对表达量变化Fig.7 Changes of CDPK20 expression during yam tuber development

2.6 相关性分析

B1中CDPK酶活性与还原糖含量呈显著负相关，与IAA含量呈显著正相关，与ABA含量呈极显著负相关。在DHCY中，CDPK活性与淀粉含量、ZR含量呈极显著正相关，与可溶性总糖含量呈显著负相关；与还原糖呈负相关。两品种山药中的IAA、ZR含量与淀粉含量呈极显著正相关，与还原糖呈显著负相关，IAA和ZR可能有助于淀粉积累和还原糖分解，为山药块茎膨大提供能量(表2)。在DHCY中ABA含量与还原糖呈极显著正相关，植物体内的ABA有助于器官的成熟，从而促进还原糖的合成。B1和DHCY中酶活性与基因表达量均呈极显著正相关(表3)。

表2 2个品种山药块茎生理指标的相关性

表3 2个品种山药块茎CDPK酶活性与基因表达的相关性

3 讨 论

CDPKs广泛存在于植物界，从绿藻到高等植物，是目前植物中研究较多、了解较为清楚的一类蛋白激酶。徐梦军等[8]对小麦TaCPK34基因沉默后发现成熟籽粒中粒长、粒宽、千粒重和淀粉含量均显著下降，表明TaCPK34可能参与小麦籽粒淀粉的合成。而本研究中CDPK酶活性与淀粉含量呈极显著正相关，与还原糖、可溶性糖含量均呈显著负相关，在块茎膨大前期需要消耗糖来提供山药块茎膨大所需要的能量，同样可表明CDPK在淀粉及糖代谢中发挥某些重要作用。研究表明，CDPKs参与调控植物激素信号通路，可以通过影响GA20ox和GA3ox来调控活性GA的合成[10]。CDPKs还参与ABA诱导的气孔运动和响应ABA信号，并且IAA处理能够增加绿豆插条 CDPKs 基因的表达[11]。Sian等[12]对大麦糊粉层原生质体用微量注射法注进钙依赖蛋白激酶的肽表明：激酶对GAs和ABA信号转导有调节作用。在本实验中，B1的CDPK酶活性与ABA呈极显著负相关，与GA3、IAA呈正相关，DHCY山药中CDPK酶活性与激素ZR呈显著正相关，表明CDPKs在植物激素信号转导中有重要作用。

CDPKs由Hetherington等[13]于1982年在豌豆(PisumsativumL.)中首先报道，目前CDPK家族基因已在多种植物中被发现并克隆。胡佳蕙等[14]从野生番茄‘潘那利’中克隆SpCPK8基因,亚细胞定位于细胞膜上，且表明SpCPK8基因能够积极响应干旱胁迫。雷蕾等[15]从茶树龙井中克隆出CsCDPK17基因，证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。赵婉莹[16]克隆了表明小麦TaCDPK1基因，并表明该基因负向调控GA的合成，定位与细胞膜和细胞核上。本研究对山药块茎的CDPK20基因进行克隆，且亚细胞定位在细胞核和细胞膜，CDPK20基因对CDPK酶有正向调控作用。CDPKs的亚细胞定位模式多样，暗示其功能的多样性。

CDPKs参与调控植物根、茎、叶的生长发育，植物的各种器官中均能检测到CDPK基因的表达。王丹丹等[17]从朝鲜淫羊霍中克隆了EkCDPK，其在根、茎、叶中均有表达。有关玉米的研究表明，CDPK基因表达水平受到抑制时，花粉的萌发以及花粉管的延伸都受到了明显的抑制作用[18]。梁述平等[19]通过研究烟草MCDPK1的表达，证明CDPK同源物会导致植物主枝花原基败育还会延长侧枝的营养生长期。马铃薯StCDPK1和StCDPK3在匍匐茎中表达，与块茎早期发育和膨大相关[20]。陈暄等[21]克隆了茶树中的钙依赖蛋白激酶基因，并且在表达特异性分析中发现它只在茶树花蕾发育后期进行表达。本研究中CDPK20基因在块茎膨大关键时期的表达量显著升高，而B1的CDPK20基因表达量在膨大期略高于DHCY，这可能与B1在山药块茎膨大中期块茎迅速伸长发育有关，其在山药不同器官中的表达模式还需进一步研究。不同植物中的CDPKs表达模式也不一定相同，越来越多的CDPKs基因正在从不同的植物中被克隆鉴定，CDPK虽不决定植物器官形成，但可能参与调控植物生长发育的过程。而CDPK在山药中怎样与下游蛋白互作、与哪些通路相关联从而影响山药块茎膨大、以及其结构和在淀粉、激素代谢中的功能还需进一步研究。