猪流行性腹泻基因工程疫苗研究进展

韩 瑞，王清华，闫鹏先，师伟伟，贺 笋

（天康生物制药有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性腹泻，其主要临床表现为呕吐，仔猪急性水样腹泻等。该病毒可以感染任意阶段的猪，成年猪临床症状不明显，但哺乳仔猪感染后症状非常严重，死亡率可高达90%，给整个养猪行业带来巨大的经济损失。PEDV于1971年首次在英国被发现，1978年于比利时分离出首个PEDV毒株，并命名为CV777，随后PEDV开始席卷整个欧洲。1982年PEDV在亚洲出现，随后在亚洲各个国家广泛流行，但随着近些年疫苗行业的发展，PEDV在亚洲的流行有所遏制。直至2010年，高致病性变异PEDV的出现引起了国内疫情大规模暴发，随后亚洲各国也相继暴发了严重疫情，给亚洲各国养猪业带来巨大的损失。2013年PEDV首次在美国被发现，随即在国内出现了PEDV大暴发，之后传至北美洲各国，致使北美各国养猪业损失惨重。由于PED对养猪行业影响逐渐增大，各国均加强了对该病的防控，但目前还没有专门针对该病的治疗药物，疫苗接种是目前最主要的防控手段。当前市面流行的主要以传统的PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗为主，但由于PEDV变异速度快，基因型种类繁多，各个猪场之间的基因型都有很大区别，这使得当前疫苗的防护效果差强人意。随着基因工程技术的发展，越来越多的基因工程疫苗，如亚单位疫苗，病毒样颗粒疫苗，重组活载体疫苗，转基因植物疫苗和核酸疫苗等逐渐被研发出来，受到企业的广泛重视。本文就当前PEDV基因工程疫苗的最新研究进展进行简要的概述。

1 PEDV病毒

1.1 PEDVPEDV属于α-冠状病毒属，病毒颗粒成不规则球形，大小不均一，粒子直径范围为130～170nm，其颗粒表面由长约18nm的棒状突起覆盖。其基因组大小约为28Kb，为单股正链RNA，整个基因组由5’非编码区，3’非编码区以及7个开放阅读框组成。病毒粒子由四种结构蛋白：纤突糖蛋白（Spike，S），包膜蛋白（Envelope，E），外膜蛋白（Membrane，M），核衣壳蛋白（Nucleocapcid，N）组成，分别由ORF2，ORF4，ORF5，ORF6基因编码。ORF1a和ORF1b约占整个基因组的2/3，主要编码nsp1-nsp16等16个非结构蛋白，主要在病毒感染、基因组复制以及转录等过程中发挥作用。ORF3编码PEDV中的唯一的一种离子通道类型的辅助蛋白，主要在病毒复制和转录中发挥重要作用。

1.2 PEDV致病机理PEDV在猪群间主要通过粪口途径传播，也可以通过粪鼻途径传播。研究发现PEDV主要在猪小肠中复制、感染，从而导致小肠上壁绒毛细胞萎缩坏死，小肠功能紊乱，电解质失衡，营养吸收不良，进而引起腹泻。

研究表明氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N，pAPN）是PEDV的一种细胞表面受体，在PEDV侵染小肠绒毛细胞中起到了一定的作用，但近期研究表明pAPN并不是唯一的受体，APN基因敲除的猪仍然可以感染PEDV，这说明还有其他的感染途径。最近研究表明除了小肠外，鼻腔粘膜也可以检测出PEDV阳性，说明上呼吸道极有可能也是PEDV的易感部位。Li等发现PEDV能够经过鼻腔黏膜下的树突状细胞的摄取进入鼻腔黏膜固有层，随后被PEDV递呈给CD3+淋巴细胞，而CD3+后淋巴细胞又经淋巴循环和血液循环迁移至肠黏膜，通过细胞间的接触导致肠道感染。PEDV进入细胞内可以通过调控各种信号途径以及细胞因子来促进自身繁殖，以及引起细胞凋亡。王晨阳等人通过敲除PEDV的ORF3以及DNA断裂的原位末端标记法发现ORF3可以抑制Caspase 3，从而抑制细胞的凋亡，同时荧光定量PCR结果显示感染正常PEDV细胞的HSP70表达量明显高于感染ORF3缺失的PEDV的细胞。此外PEDV还可以通过炎症应激调控炎症因子相关网络，促进IL-8的释放从而引起炎症反应，从而导致细胞死亡，达到持续感染的目的。最近研究发现PEDV感染后会激活细胞外信号激酶（ERK），压力激活蛋白激酶（SAPK）信号通路参与细胞的复制和凋亡，更加有利于PEDV的持续感染。

2 基因工程疫苗

2.1 亚单位疫苗PEDV颗粒表面的棒状突起主要是由S蛋白组成，S蛋白含有多个B淋巴细胞抗原表位，主要在细胞侵染、细胞融合方面起到重要作用，同时也是产生中和抗体的主要结构蛋白。Makadiya等人分别在酵母，昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达了S1结构域，免疫小鼠后能够产生较高的IgG和IgA抗体滴度，中和实验结果表明动物体内产生较高的中和抗体，在免疫后28d中和抗体滴度能达到1:100左右。S蛋白胞外结构域中含有一个核心中和表位（COE），包含S蛋白的第499-638位氨基酸，能够诱导机体产生针对PEDV的中和抗体。Li等人将沙门氏菌鞭毛蛋白(rSF)以佐剂的形式与COE重组形成rSF-COE-3D融合蛋白，将该融合蛋白作为抗原对猪进行3次免疫，ELISA检测发现动物体内产生了高滴度的IgG和IgA，血清中的中和抗体滴度大于250，同时体内产生大量的IFN-γ和IL-4，攻毒后仔猪腹泻率大幅降低，能够起到一定的保护作用，这可能与鞭毛蛋白密切相关，鞭毛蛋白具有能够引起免疫应答的优势表位，从而刺激机体产生T、B细胞免疫应答。Chang等人采用HEK293细胞成功表达了S-LTB三聚体融合蛋白，通过肌肉注射方式免疫5周龄的猪，虽然可以产生特异性的IgG和IgA，但在粪便中特异性IgA水平较低。

亚单位疫苗与灭活疫苗以及弱毒活疫苗相比，拥有安全性高、产量高、生产成本低等众多优势，但由于亚单位疫苗免疫原性较弱，抗体水平较低，保护时间较短等诸多限制因素，后续研究可以从免疫方式，免疫佐剂的选择等方面进行探究。其中免疫佐剂的研究尤为重要，良好的佐剂可以将完整构象的抗原分子递送到免疫细胞，能够刺激机体产生有效的中和抗体。

2.2 病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是由病毒的一种或多种蛋白自组装而成的和病毒类似的空心颗粒，无病毒核酸，无复制能力，具有很强的免疫原性和生物学活性，是当前疫苗研究的一个重要方向。

Wang等人利用昆虫杆状病毒系统成功构建出了PEDVVLPs，对6周龄左右的小鼠2次免疫，分别在第2、4、6周后取血测定中和抗体滴度及IL-4水平，结果表明PEDVVLPs能够引与灭活疫苗相当的中和抗体，同时能够产生更高水平的IL-4。Lu等人将PEDV S蛋白的B细胞表位748YSNIGVCK755插入至乙型肝炎病毒核心衣壳蛋白上(HBcAg)，通过HBcAg的自组装功能将B细胞表位展示于VLPs表面，4次免疫后检测发现中和抗体滴小于1:20，但有意思的是在母猪分娩后母乳中的中和抗体水平逐渐增加，平均中和滴度能够达到1:120，小肠病理切片显示疫苗可以对小肠起到较好的保护作用。王翠玲通过分别构建pFast-Bac-Dual-2S、pFastBac-Dual-2M、pFastBac-Dual-2E 质 粒，利用昆虫杆状病毒系统通过共感染的方式感染Sf9细胞制备出PEDV VLPs，通过肌肉注射的方式免疫小鼠，机体产生较高的滴度中和抗体，同时能诱导脾淋巴细胞产生较高滴度的IFN-γ和IL-4，表明PEDV VLPs可以激活机体的体液免疫和细胞免疫系统。作者又再次构建了CTB融合蛋白质粒并获得拯救病毒pFastBac-Dual-2CTB，与其他拯救病毒共转细胞获得CTB嵌合的PEDV VLPs，通过口服的方式对小鼠和猪进行免疫/抗体中和实验，间接ELISA以及ELISpot分析表明CTB嵌合的PEDV VLPs比未嵌合的VLPs能够引起更强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

3 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是指将编码有效抗原蛋白的基因重组到活载体上并使之表达的疫苗。活载体疫苗相较于传统疫苗来说生产成本低、安全性好、能够引起足够强大的免疫应答，可以在同一载体上插入不同的抗原基因，可用于研制多价多联疫苗。目前还没有兽用活载体疫苗上市，人用活载体疫苗的研究，产业链相对完成成熟，已经有相应产品上市。重组活载体疫苗主要包括病毒活载体疫苗和细菌活载体疫苗。

3.1 病毒活载体疫苗Chang等利用昆虫杆状病毒系统分别将S蛋白和S1蛋白基因重组至杆状病毒基因组上形成S-Bac和S1-Bac，然后将病毒分别对小鼠和猪进行肌肉注射免疫，S-Bac和S1-Bac均可以在体内产生较高的IgG水平，但S-Bac可以产生更高的中和抗体，攻毒后显示S1-Bac出现了较轻的临床症状，而S-Bac几乎没有出现临床症状。Ke等利用减毒重组水泡性口炎病毒(rVSVMT)为活载体，将删除胞内域19个氨基酸的S蛋白基因插入到载体中，成功构建了重组病毒VSVMT-SΔ19，通过免疫小鼠发现体内产生PEDV中和抗体滴度为1:100，母猪免疫后产生的PEDV中和抗体滴度为1:250，而且母猪分娩后5d内的母乳中抗体滴度也达到了1:150，攻毒结果显示对照组能够足够完全保护仔猪，保护率达100%。Liu等成功构建了rAd-PEDV-S病毒，病毒在细胞中的滴度达到了1011PFU/mL，在4周龄的猪中进行免疫评估，发现只能够产生体液免疫，细胞免疫并不明显，不能对仔猪提供完全保护。

3.2 细菌活载体疫苗Hou等采用乳酸杆菌为表达载体，将枯草芽孢杆菌的聚谷氨酸合成酶A蛋白（pgsA）作为锚定基质，并与PEDV N蛋白基因融合，将其展示到乳酸杆菌表面，通过口服和鼻内免疫对母猪和小鼠进行接种，在接种后14d出现特异性IgG抗体，ELISA结果表明母猪血清中有较高的IgG抗体，更重要的是母猪初乳中的IgA水平明显高于IgG水平，仔猪腹泻率显著降低。Wang等将PEDV COE基因重组到枯草芽孢杆菌中获得B.subtilis-RC重组菌株，通过口服给药的方式对猪进行免疫，ELISA结果表明血清中具有较高滴度的IgA和IgG抗体水平，同时口服免疫还导致内皮淋巴细胞数量明显增加，流式细胞结果发现CD3+T淋巴细胞的数量明显增加，并上调了CD4+/CD8+T细胞的比例，总之，B.subtilis-RC可以引起高水平的局部和全身免疫反应。

4 转基因植物疫苗

植物作为蛋白表达载体的研究由来已久，作为高等真核生物，在体内可以对目的蛋白进行正确的折叠和翻译后加工，形成具有正确结构和功能的抗原，同时植物疫苗易于生产，储存，安全性高，可以广泛应用于疫苗生产中。但目前植物疫苗表达量普遍偏低，产业链不完成，因此产业化还需时日。

Ho等成功构建了稳定表达PEDV COE蛋白的转基因烟草，通过Western Blotting鉴定COE蛋白已经成功表达，且目的蛋白约占总蛋白的4%，达到234mg/kg，小鼠免疫结果表明植物疫苗可以刺激机体既可以产生体液免疫又可以产生细胞免疫，但中和抗体滴度只有1:60左右，需要从抗原设计方面进一步提高中和抗体滴度。Huy等成功构建了PEDV COE基因与M细胞靶向配体（Co-1）基因的融合蛋白基因（COE-Co-1），并将COE-Co-1基因导入至水稻愈伤组织，Western Blotting分析表明COE-Co-1蛋白已经成功稳定表达，目的蛋白占可溶性蛋白的0.083%，通过口服给药的方式发现该抗原可以引起系统性免疫反应和粘膜免疫反应。Egelkrout等成功构建了表达PEDV S1蛋白的转基因玉米，目的蛋白表达量可以达到20mg/kg，通过喂食方式进行粘膜免疫，ELISA结果表明其引起的中和抗体水平与商业疫苗相一致，可作为口服疫苗添加于饲料中。

5 核酸疫苗

核酸疫苗主要包括DNA疫苗和mRNA疫苗，其具有生产时间短，安全性高，免疫原性高等诸多优点。但同时也面临着生产成本，储存运输，技术要求高等劣势。2014年Harrisvaccines公司已经在美国申请了PEDV mRNA疫苗，而我国的兽用核酸疫苗目前还处于研发中。

Zhang等成功构建了PEDV S1蛋白与TGEV S蛋白基因的融合基因SL7207(pVAXD-PS1-TS)，利用减毒沙门氏菌作为传递载体进行口服给药，在给药后2周抗体开始出现，6周时抗体水平达到顶峰，8周时抗体水平开始下降，血清中含有高滴度的中和抗体，同时也观察到T淋巴细胞免疫引起的IFN-γ和IL-4水平的提升。其他众多研究均发现核酸疫苗既可以刺激机体产生高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答。

核酸疫苗是近些年来，尤其是新冠疫情以来最受瞩目的疫苗种类之一，尤其是mRNA疫苗具有抗体产生速度快、抗体滴度和保护率高、有效保护变异毒株等显著优势，已经在新冠疫苗上成功应用。相信随着mRNA技术的发展和产业链的完善，mRNA疫苗也必将应用于兽用疫苗研发中。

6 展望

随着养猪行业的崛起，猪病疫情的防控已成必然趋势，高毒力的PED正在席卷全球，而接种疫苗是最有利的防控措施。PEDV作为一种肠道感染病毒，主要是刺激肠道免疫产生有效的中和抗体，而传统疫苗则是刺激机体产生有效的血清IgG抗体，很少产生sIgA抗体，而最新的研究表明粘膜免疫刺激机体产生的sIgA抗体才能更有效的降低仔猪感染PEDV，降低死亡率。随着分子生物技术和基因工程技术的发展，PEDV基因工程疫苗的研发也将迎来大暴发，多种安全、有效、廉价的基因工程疫苗势必会对养猪行业有巨大的帮助，且随着基因工程疫苗的发展，未来免疫方式也势必会逐渐实现从肌肉注射到口服给药的逐步转变，可以有效的刺激肠道产生更有效的sIgA抗体，提高仔猪的存活率，同时mRNA疫苗等新型的出现让我们看到了未来疫苗研发新的方向，带动整个行业的蓬勃发展。