生物制品中内毒素的危害及其去除方法的研究进展

李生军， 张海霞， 冯若飞*

(1.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

在生物制剂生产过程中由于不可避免的细菌污染，导致革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分残留于生物制剂中，这种脂多糖是由革兰氏阴性菌死亡或分解后释放的，又称内毒素[1]。革兰氏阴性菌中最具代表的大肠杆菌由于其具有转化效率高、重组蛋白产率高、易于控制和易于放大等优点，因此，被广泛应用于重组蛋白的表达[2]。然而，大肠杆菌表达的重组蛋白在纯化过程中同时伴随着内毒素的残留，由于机体对残留的LPS有免疫识别作用，在机体内作用于单核巨噬细胞并产生多种细胞因子，适量的细胞因子可激活免疫系统，对机体有益，而过量则可引起机体严重的病理反应，轻微时表现为发热、休克、心率过快，严重时生物制剂中残存的LPS经血液引起致命性败血症，并伴有多器官功能衰竭甚至死亡[3-4]；每年全世界有超过500万人死于败血症，败血症的治疗已成为现代医学的一个严峻挑战，细菌来源的生物制剂从本质上限制了其在人类和其他哺乳动物中的使用[5]。因此，必须对生物制品中的内毒素进行去除或使其达到药品规定的内毒素含量标准后方可使用[5]。目前报道去除内毒素方法根据作用方式主要有超滤法、活性炭吸附法、亲和吸附法、离子交换层析等。

1 内毒素的结构特征

LPS是革兰氏阴性菌细胞膜上的主要结构成分，包被约四分之三的外膜，LPS由多糖O抗原(O-PS)、核心多糖(C-OS)和类脂A(Lipid A)构成[6]。O-PS由2～6个寡聚糖组成，是LPS中最容易发生变异的部分，由于细菌种类不同所以多糖O-PS组成亦不同；C-OS主要的作用是连接类脂A和O-PS，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸等组成[7]。类脂A是LPS中最小的结构单位，也是最为保守的部分，同时也是LPS的活性中心，决定着细菌的致病性，其成分是由氨基葡萄糖双糖构成的亲水性骨架和疏水性脂肪酸链组成的磷脂[6]。迄今为止，多种细菌类脂A的化学结构已被测定，主要不同之处在于脂肪酸和磷酸基团的差异[8]。

脂类A作为LPS生物活性的主要集中部分，通过与靶细胞的受体蛋白分子相互作用，激活复杂的信号通路，最终导致机体发生一系列病理反应，类脂A过度刺激天然免疫会导致器官损伤，严重休克，甚至可能会导致哺乳动物和人类死亡[9]。

2 内毒素与外毒素的区别

内毒素由革兰氏阴性菌产生，其主要成分是脂多糖，具有很强的耐高温属性，250 ℃高干热灭菌才能破坏其生物活性，故难以彻底清除[10]。在细菌入侵机体时没有组织器官的选择性，内毒素会因细菌种类的不同存在或多或少的差异，但是致病后的临床症状却大同小异，主要表现为腹泻、发热、败血症等[11]。外毒素主要是由革兰氏阳性菌产生，例如破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、肉毒梭菌，部分革兰氏阴性菌也可产生，如产毒性大肠杆菌，以及霍乱弧菌等[12]。其主要成分是蛋白质，因此，对化学物质和热原很敏感，极易丧失生物活性，用3%～4%的甲醛溶液处理其毒性可完全消失，但是其抗原性较强，可诱使机体产生抗毒素[13]。

3 内毒素的致病性

3.1 发热反应

人体对LPS极为敏感，极微量内毒素就能引起体温上升，这主要与脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、白细胞分化抗原(CD14)所介导的反应有着密切的关联。当机体受到细菌感染后，LPS与LBP结合，并与LPS的受体CD14形成LBP-LPS-CD14复合体，由于CD14没有胞内结构，同时也没有蛋白酶水解活性，导致CD14无法单独将胞外信号传递至胞内，此时Toll样受体4就承担起跨膜信号传导的重任[14-15]。LBP-LPS-CD14复合体激活TRL14，TRL14与Toll/interleukin-1 receptor(TIR)区域相互作用，激活髓性分化因子88(MyD88)、IL-1R相关的激酶(IRAK)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，这些相关因子分别被磷酸化后向细胞核内移位并作用于相应的转录因子，从而启动核内基因表达，激发LPS刺激所介导的细胞反应，致使细胞分泌大量的TNF-α、IL-6以及IL-1，最终刺激免疫系统抵抗入侵的细菌和引发炎症反应，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热[16-19]。

3.2 内毒素休克

当机体中侵入大量革兰阴性病原菌并死亡时，会在机体中释放大量LPS进入血液，使机体发生内毒素血症。而这些机体中的内毒素作用于巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板以及补体系统和凝血系统等，并产生IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α、组胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血管临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等功能紊乱而导致微循环障碍，这种病理反应叫做内毒素休克[20]。当机体接受有效的治疗后，会导致细菌大量死亡崩解，进一步导致血液中内毒素升高，并加重内毒素血症。大量的动物实验及临床实践表明，内毒素可造成人及动物多系统的多种疾病，其中包括肺损伤、肝损伤、肠损伤、肾损伤及弥漫性血管内凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能脏器衰竭[21]。

4 内毒素的去除方法

4.1 超滤法

随着膜分离技术的迅猛发展，在生物制药中利用物质分子大小去除内毒素的超滤法越来越受研究者的青睐。罗濛[22]利用截留相对分子质量为30万的超滤膜对狂犬病疫苗进行浓缩超滤，内毒素检测结果显示，去除效率可达87.5%～98.7%。李村玉等[23]采用截留相对分子质量10×103的超滤膜对甘草酸中的内毒素进行超滤，并以超声进行辅助，实验结果显示，内毒素去除率可达93.7%，超声后的甘草酸的透过率可达92.3%，有效的提高了制剂的安全性。超滤法是基于分子量的大小去除内毒素，适用于水溶液和小分子溶液去除内毒素，在蛋白质等大分子物质使用超滤法会导致有效分子大量流失。

4.2 吸附法

4.2.1 活性炭吸附法

活性炭由于其表面积大、吸附能力强、价格低廉、操作简易等优点，被广泛的用于内毒素去除，最适用于去除低分子量疏水性内毒素，在微酸性条件下去除效果最佳。李淼等[24]采用活性炭吸附研究热毒宁注射液中细菌内毒素去除效果，实验结果表明，活性炭对内毒素吸附率为78.7%，能够有效的截留细菌内毒素，提高了热毒宁注射液的安全性。孔祥文等[25]以活性炭为吸附剂，以牛血清白蛋白、牛血清红蛋白、溶菌酶溶液为原材料，活性炭的吸附效率分别为33.1、51.1和216.5倍。但是由于活性炭的非选择性，所以目的蛋白过多损失，且样品处理后的活性炭不易除去，影响产品的后续使用。

4.2.2 亲和吸附法

亲和吸附法采用种类繁多的吸附剂，是以琼脂糖等为基质，通过与内毒素有特异性相互作用的配基偶联。吸附剂配基带的正电荷与内毒素磷酸基团之间的离子作用，使得吸附剂对制剂中的内毒素有高度的特异性与选择性；比较其他方法，在目标蛋白损失最小的情况下，能更有效地去除制剂中的内毒素[5]。Petsch等[26]以聚赖氨酸、多黏菌素和组氨酸为配基的亲和膜为材料，研究亲和膜对内毒素的吸附去除效果，实验结果表明，以上配基均有很好的去内毒素效果。Wei等[27-28]研究以脱氧胆酸、聚赖氨酸、聚二甲亚胺以及各种氨基酸为配基的亲和吸附剂去除内毒素，实验表明以上配基所带的电荷以及配基的极性对吸附内毒素的效果有很大的影响；此外，脱氧胆酸、聚赖氨酸、聚二甲亚胺等聚阳离子配基对去除带正电荷的内毒素均很有效。

4.3 离子交换层析

根据样品和内毒素等电点的不同，可以选用不同的阴离子和阳离子交换介质，使内毒素分离的同时达到蛋白纯化的目的。姬秋彦等[29]用阴离子交换层析柱Capto Q和Capto adhere去除百日咳和丝状血凝素中的内毒素，可以达到现行国外联合疫苗实施的标准，并且纯化后的样品保持较好的活性。肖兰艳等[30]采用离子交换法去除重组巴西坚果过敏原蛋白Ber e1溶液中的内毒素，去除率为99.99%，内毒素浓度为6.25 EU·mL-1，蛋白回收率为42.8%。徐向荣[31]通过Q Sepharose层析法去除内毒素，重组人血清白蛋白干扰素中的内毒素在介质上的结合力比蛋白质强，所以很难洗脱，用高盐缓冲液才能洗脱内毒素，最终溶液中内毒素含量降低，同时纯度也有所提高。

5 问题与展望

超滤法和活性炭吸附法由于对目标分子是非特异性选择，所以会导致有效分子流失[32]；活性炭吸附法在样品处理后活性炭不易除去，影响产品的后续使用；而亲和吸附法和离子交换层析对制剂中的内毒素有高度的特异性与选择性，相比较而言，在目标蛋白损失最小的情况下，能更有效地去除制剂中的内毒素[33]。

内毒素普遍存在于生活中，适量的内毒素可促进细胞因子激活免疫系统，对机体有益，而过量则可引起机体严重的病理反应，所以注射制剂中内毒素的检测和控制显得尤为重要。除去上述各类研究外，研究人员在细菌内毒素检查方法方面也倾入了很大的心血，譬如常见的检测方法主要有家兔法、鲎试剂法、微量凝胶法以及重组C因子法。但是诸多检测方法也存在或多或少的缺陷，例如家兔法不能定量检测热原、使用动物实验检测周期长、灵敏度低等，因此，家兔法正在逐步被取代，而微量凝胶法也存在假阳性太高的缺陷[34]。目前鲎试剂法以灵敏度高、操作简易而最常用，但是随着环境的恶化以及过度捕杀，中华鲎和圆尾鲎已经成为濒危生物，所以急需内毒素检测代替方法进行弥补[12]。相信在众多研究者的努力下定能力克万难，为保障生物制剂安全再添浓墨重彩的一笔。