表面增强拉曼光谱法分析米鱼肌肉中组胺

余志引， 蔺磊

(1.浙江杰力惠农业科技有限公司，浙江 杭州 310015； 2.浙江农艺师学院，浙江 杭州 310021；3.浙江大学 生物系统工程与食品学院，浙江 杭州 310058)

生物胺是一类非挥发性的脂肪族、脂环族或杂环类的含氮有机化合物的总称，具有一定的生物活性，广泛存在于生物体及多种食品中[1]。机体中适量的生物胺具有重要的生理活性，如调节神经递质的分泌、控制血压、参与免疫反应等[2-4]。但当生物胺摄入过高或在体内大量累积时则可能对机体产生毒性。其中，组胺是毒性最强的生物胺，摄入组胺含量为80～400 mg·kg-1的鱼肉就可能产生轻微中毒反应[3]，而当摄入浓度超过1 000 mg·kg-1时便会有严重中毒反应，症状包括呕吐、头晕、腹泻、过敏等，严重的还可导致休克，甚至危及生命[5]。我国卫生部发布的国家标准《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[6]规定组胺含量鲐鱼≤1 000 mg·kg-1、其他鱼类≤300 mg·kg-1；而欧盟限定鱼肉中组胺的平均含量≤100 mg·kg-1[7]。此外，美国FDA还将组胺含量超过50 mg·kg-1作为评判鱼肉变质的标准[5]。因此，准确快速地检测鱼肉中组胺的含量，对保证鱼肉品质及消费者的健康安全具有重要意义。

传统对于鱼肉中组胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、荧光定量法、离子交换色谱法、毛细管电泳法和酶联免疫吸附法(ELISA)等[8-11]，这些方法虽然灵敏度较高，但由于实验前处理繁琐、检测耗时较长、仪器携带不便和试剂价格贵等原因均具有一定的局限性。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度的指纹图谱，“表面增强”一词是指化合物分子吸附到某些纳米级粗糙金属(如金、银、铜)的表面或溶胶中，其拉曼信号成几何倍数的增强[12-14]，因此，SERS技术能实现对微量样品和单分子的快速检测。同时，SERS具有前处理方法简单、仪器携带方便且检测速度快等优点，在农产品残留农药的快速筛查[15]、食品中痕量物质的检测[16]、环境中危害物的检测[17]等方面应用广泛。Gao等[18]采用分子印迹聚合物(MIPs)法结合SERS技术，以金纳米粒子为增强基底，成功建立了快速检测金枪鱼罐头中组胺含量的方法，检测范围为3～90 mg·kg-1；Xie等[19]采用SERS联合薄层色谱(TLC)法建立了快速筛查鱼肉中组胺的方法，其准确度和灵敏度可以媲美欧盟(EU)官方使用的HPLC；Zhang等[20]利用SERS技术分析了芽孢杆菌的生物标志物二皮考啉酸钙(CaDPA)的含量，结果表明以银纳米球为基底，仅5 s的数据采集便可快速分析得到相当于104孢子量的CaDPA，显示出SERS在环境危害物检测方面较好的应用前景。然而，采用SERS技术检测新鲜鱼肉中组胺含量的研究报道较少。因此，本文以石首科新鲜米鱼肌肉为载体，模拟鱼肉在储存过程中组胺的变化，以金纳米溶胶为基底，利用SERS技术结合密度泛函理论对鱼肉中组胺含量进行定性定量分析，并用国标法进行验证；最后，采用SERS对4 ℃下放置了1、4、7 d的米鱼肉中组胺的含量进行预测，用国标法进行结果评判。

1 材料与方法

1.1 材料

组胺(分析纯99.7%，Sigma-Aldrich)；硝酸银、高氯金酸、柠檬酸三钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、正己烷、碳酸钠、正丁醇、氯仿、谷氨酸钠、丙酮、乙醚、甲醇等化学实验试剂均为分析纯(上海晶纯实业有限公司)；新鲜米鱼由奉化兴洋水产食品有限公司提供，捕自宁波奉化海产品捕捞基地，冰温条件下12 h内运往实验室-20 ℃冻存。实验用水为二次去离子水。

1.2 实验仪器

1.3 样品制备

内标液为浓度200 mg·L-1组胺标准品。配置组胺的标准液分别设置浓度为0.5、1、10、5、25、50、75、100 mg·L-1。制作17份米鱼肉样本，配置组胺浓度为1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、95、100 mg·L-1，预留空白样本。

选取4 ℃下放置1、4、7 d的米鱼肉各5份，参照GB/T 5009.208—2008中HPLC浓度检测检验方法准确度。

取米鱼背部肌肉切碎，每份5 g。样品匀浆后按1∶5的料液比加入12%浓度的三氯乙酸，60 W功率下超声提取15 min，3 600 r·min-1离心5 min，取上清用定量滤纸过滤，重复提取1次，合并上清液，用三氯乙酸定容至50 mL(样本制备40 min完成，取待测液预备拉曼上机)。

除脂：取10 mL待测液于25 mL具塞试管中，加入等体积正己烷，涡旋振荡5 min，除去有机相，重复进行2次。

萃取：将上述除脂后溶液加入适量氯化钠使其饱和，准确移取2.0 mL于15 mL离心管中，用2 mol·L-1的NaOH溶液调pH至12，加入2.0 mL正丁醇-氯仿(1∶1)混合溶液，涡旋振荡5 min后于3 600 r·min-1离心5 min，取上层有机相，重复萃取2次。合并萃取液，加入2滴1 mol·L-1的盐酸并混合，于40 ℃水浴下氮气吹干，加入0.1 mol·L-1的盐酸1.0 mL溶解残留物。

衍生：取上述待衍生溶液0.5 mL于10 mL具塞试管中，加入1.5 mL饱和碳酸钠溶液(现配)和1.0 mL丹磺酰氯(10 mg·mL-1丙酮溶液)衍生溶液，振荡混匀后于60 ℃烘箱中反应30 min，中间振荡2次。取出后加入100 μL谷氨酸钠(50 mg·mL-1饱和碳酸氢钠溶液)，振荡混匀，60 ℃保温15 min，加入1 mL超纯水，于40 ℃水浴下氮气吹去丙酮，加入3 mL乙醚萃取，得乙醚相，重复萃取2次，合并乙醚萃取液，氮气吹干后加入1.0 mL甲醇溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤(样本制备7 h完成，用HPLC测定)。

胎儿期动脉导管开放，又无肺气的干扰，经连续三血管切面及弓降部冠状切面的综合扫查，能较快速发现血管环并经弓降部冠状切面进行确认及进一步诊断，同时可观察气管受压的情况及有无其他畸形。对胎儿出生后能否得到及时、有效治疗，提高胎儿存活率有重要的意义。

1.4 银纳米溶胶和金纳米溶胶基底制备

金纳米溶胶基底制备采用文献[12]中的柠檬酸三钠加热还原法，其制作过程如下：将一定浓度的高氯金酸溶液(10 mg高氯金酸溶于200 mL超纯水中)倒入烧瓶中，放在恒温磁力搅拌器上，温度控制在120 ℃恒定加热至沸腾后，迅速加入一定浓度的柠檬酸三钠溶液(20 mg柠檬酸三钠溶于4 mL超纯水)，同时以100 r·min-1转速快速搅拌，制备成的金纳米溶胶颜色为酒红色。待溶液冷却后，将上述适量胶溶液倒入离心管中，离心后倒掉少量上清液，再往离心管中加入适量超纯水，用超声振荡混匀，经多次提纯后，避光保存。

银纳米溶胶基底制备采用Lee-Meisel的柠檬酸三钠加热还原法，参照相关文献[13]制作：将一定浓度的硝酸银溶液(36 mg硝酸银溶于200 mL超纯水)倒入烧瓶中，放在恒温磁力搅拌器上，高温迅速加热到沸腾，在2 min内逐步滴入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液(60 mg柠檬酸三钠溶于6 mL超纯水)，同时以200 r·min-1的转速搅拌，此时溶液慢慢由透明变淡棕色，反应25 min后得到灰绿色液体，避光保存。

1.5 高效液相色谱试验条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；检测器为光电二极管阵列检测器(DAD)；流动相：A-甲醇，B-水；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱试验梯度洗脱的程序

1.6 拉曼光谱采集

拉曼光谱数据采集之前，用乙腈校正仪器采用785 nm激发波长。参数如下：功率为200 mW，扫描范围200～3 300 cm-1，光学分辨率2 cm-1，积分时间10 s，采集3次取平均光谱值。将组胺粉末用载玻片压平在石英板上，用配套显微镜平台进行组胺固体采集。向2 mL石英瓶中依次加入500 μL纳米增强剂、100 μL待测液、100 μL氯化钠，放入配套液体样品池进行SERS采集。所有数据分析基于MATAB R2014a、Gaussian.v 09、OMNIC v8.2、Origin v8.0、SPSS v17.0平台完成。

2 结果与分析

2.1 组胺的拉曼光谱

图1 组胺的分子结构

图2是组胺的拉曼光谱，其中图2中a为组胺标准品固体的拉曼光谱，图2中b是采用密度泛函理论计算模拟得到的组胺拉曼光谱。从图可看出，谱峰321、376、647、811、1 032、1 099、1 376、1 432、1 477 cm-1与密度泛函理论计算谱峰319、379、648、811、1 030、1 098、1 291、1 377、1 433、1 478 cm-1基本一致。对组胺进行谱峰归属[14-16](表2)，其中谱峰321、376 cm-1为组胺分子中骨架表面外弯曲振动，谱峰647和811 cm-1是组胺分子表面外环振动，谱峰1 032 cm-1为组胺分子的C—H表面内变形振动，谱峰1 099 cm-1为组胺分子的C—N伸缩振动，谱峰1 376、1 477 cm-1为组胺分子环伸缩振动，谱峰1 432 cm-1是组胺分子的环振动和N—H基团的表面内弯曲振动共同作用。这些谱峰可作为组胺的拉曼特征峰。

图2 (a)组胺粉末及其分子模拟(b)计算得到的拉曼光谱

2.2 不同纳米增强基底对组胺标准品分子的增强效果

图3中a和b分别是浓度为100 mg·L-1的组胺标准溶液银纳米基底和金纳米基底SERS光谱，图3中c和d为组胺溶液拉曼光谱和三氯乙酸溶剂的拉曼光谱图。组胺普通拉曼光谱所获得谱峰为溶剂三氯乙酸有效特征峰432、749、844、939、1 339 cm-1。而在SERS光谱图中a和b获得953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1处的组胺拉曼峰较强，这些特征峰的谱峰归属结果见表2。

表2 组胺分子的拉曼谱峰归属

通过使用TEM透射电镜表征2种增强剂。对比图3中a和b，银纳米粒子直径约60 nm，金纳米粒子直径40 nm，2种纳米粒子的粒径大小都较均匀。金纳米溶胶对组胺分子的拉曼信号强度更高，在953、992、1 262、1 106、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1处增强效果明显，说明金纳米基底能够有效吸附阴性组胺分子，获得更强信号效果，后续研究采用金纳米增强基底。由于不同种类物质的拉曼增强效应差异较大，且不同增强基底对同一物质的增强效应不同[16]。在今后研究中，可进一步探讨适合于组胺的纳米增强基底，以提高方法的灵敏度。

对组胺标准溶液的表面增强拉曼光谱进行平滑、基线校正等预处理，以去除噪声和基线漂移的影响，图4为经预处理后不同浓度组胺标准品SERS谱图。从图中可看出，随着组胺浓度的降低，组胺分子953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1的9处拉曼峰强度逐渐减弱，易识别；浓度为0.5 mg·L-1时，无法检测到有效谱峰，谱图与三氯乙酸SERS信号一致。由此表明，利用金纳米溶胶增强拉曼光谱技术检测组胺溶液的最低浓度为1 mg·L-1。

A—组胺溶液银纳米溶胶；b—组胺溶液金纳米溶胶；c—组胺;d—溶剂三氯乙酸。图3 组胺溶液的SERS光谱及组胺、三氯乙酸的拉曼光谱

a～h依次为100、75、50、25、10、5、1、0.5 mg·L-1。图4 不同浓度组胺溶液的SERS光谱

2.3 米鱼中组胺的表面增强拉曼光谱检测结果

图5是经过光谱预处理后不同组胺含量的米鱼肉提取液SERS谱图，从图中可以发现，受米鱼肉提取液中含有大量蛋白质、脂肪等物质的影响，获得大量拉曼谱峰信号，扣除图5中q米鱼空白SERS光谱信号，可明显识别5处组胺分子拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，随着浓度降低，谱峰强信号逐渐减弱。当浓度在1 mg·L-1时，依然可以识别。由此断定，这5个谱峰可作为米鱼肉中组胺定性定量判别的依据，利用SERS方法对米鱼中的组胺最低检测浓度为1 mg·kg-1。国际标准规定米鱼中组胺最大残留量为100 mg·kg-1，此方法能达到定性定量分析的要求。

a～q依次为100、95、90、80、75、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、1、0 mg·L-1。图5 经过光谱预处理后不同浓度含量组胺的米鱼肉提取液SERS曲线

由于1 262 cm-1处特征峰的峰强较高，且附近没有叠峰和杂峰影响，选用该特征峰的峰强度建立米鱼中组胺含量的定量分析模型。图6和图7是以1 262 cm-1处组胺SERS特征峰强度与组胺浓度制作的一元线性标准曲线，在浓度范围为0～100 mg·L-1时，线性方程为y=27.889x+106.25，相关系数R2=0.980 6，线性相关性良好。

图6 米鱼中不同组胺含量在1 262 cm-1特征峰处的峰强度

图7 以1 262 cm-1处组胺SERS特征峰强度与组胺浓度拟合得到的一元线性标准曲线

2.4 模型准确度验证

为了验证方法的准确度，本实验对米鱼肉中组胺真实含量进行预测，选取4 ℃下放置1、4、7 d的米鱼肉各5份，共计15个样本，分别采集SERS信号，每个样本采集6次。并用HPLC国标方法测定15个样本的真实值，比较真实值与预测值。表3为米鱼肉中组胺的真实值与预测值对比结果，相对标准偏差为2.6%～4.7%，回收率为87.0%～117.3%。SERS技术的预测值与HPLC方法的测量值基本一致，表明利用表面增强拉曼光谱方法快速检测米鱼肉中组胺含量是可行的。说明所建立方法的精密度、准确度较好，可靠性较高。

表3 米鱼肉中组胺含量所测得真实值与预测值

3 小结与结论

采用表面增强拉曼光谱技术和快速溶剂提取前处理方法检测米鱼中组胺含量，找到组胺的5处拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，将这些特征峰作为组胺的定性定量判别依据，对比不同纳米增强剂效果，得出金纳米粒子对组胺分子的增强效果更好，该方法对米鱼中组胺最低检测浓度为1 mg·L-1，在组胺1 262 cm-1特征峰峰强与组胺浓度建立线性方程，呈良好的线性相关性，方法的回收率为87.0%～117.3%，相对标准偏差在2.6%～4.7%。

用3个放置不同天数的15个米鱼肉样本验证预测模型的精确性，结果表明，SERS技术的预测值与HPLC方法的测量值基本一致；预测值与实际测量值之间无显著差异，说明采用该方法检测米鱼肉中的组胺是准确可靠的。研究结果表明，SERS技术能够对米鱼中组胺检测提供快速、新颖、准确的研究思路。