缺氧诱导因子调节铁调素在肾性贫血中的研究进展*

张泽宇， 尹良红

（暨南大学附属第一医院肾内科，广东广州510630）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一种威胁生命的疾病。研究估计全球CKD 患病率为11%～13%[1]，而中国CKD 患病率为10.8%（约1.195亿）[2]，且发病率和患病率仍不断增加。贫血是CKD的常见并发症，终末期肾脏病患者约80%伴有贫血，需要接受临床治疗。目前普遍认为，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）绝对或相对减少和铁绝对或相对缺乏是导致肾性贫血的主要原因。基于以上观点，对CKD贫血的管理包括：注射促红细胞生成刺激剂（erythropoiesis-stimulating agents，ESAs）和补充铁剂。然而，由于CKD 患者高水平的铁调素（hepcidin）阻碍铁吸收和铁利用引起“功能性铁缺乏”并导致EPO 抵抗[3]。高剂量ESAs和铁剂的应用使患者高血压、血栓形成、感染、氧化应激和心血管疾病风险显著升高[4]，因而限制了这些药物的应用。新型药物缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂（hypoxia-inducible factor prolyl-hydroxylase inhibitor，HIF-PHI）通过抑制脯氨酰羟化酶（prolyl-hydroxylase，PHD）稳定缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF），增强HIF诱导的EPO 表达以促进红细胞生成，同时显著下调铁调素，改善铁代谢紊乱，共同缓解CKD患者贫血。本文将对HIF调节铁调素在肾性贫血中的作用进行综述。

1 肾性贫血机制

肾性贫血发病机制复杂多样，目前普遍认为EPO 产生不足和铁缺乏是肾性贫血的主要原因，而炎症和尿毒症毒素（uremic toxins，UTs）等导致了贫血的恶化。EPO 由肾脏（约90%）的肾促红细胞生成素 产 生 细 胞（renal erythropoietin-producing cells，REPCs）产生，作用于骨髓成红细胞（erythroblast）表面EPO 受体（EPO receptor，EPOR），通过EPO/EPOR/Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）途径激活下游信号，调控细胞增殖、分化以及抗凋亡[5]。EPO 产生不足时会导致成红细胞凋亡。EPO 的表达受到HIF 的调控。HIF是由一个调节型α亚基（HIF-α）和一个组成型β亚基（HIF-β）构成的异二聚体转录因子[6]。在低氧条件下，HIF 能激活一系列低氧相关基因，这些基因编码EPO、EPOR、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、血管内皮生长因子和糖酵解的合成酶，以刺激红细胞生成和血管生成，增加能量供应并调节铁代谢[7]。PHD 是HIF 降解反应的限速酶，能使HIF-α 脯氨酸残基羟基化，导致HIF-α 的泛素化降解，这是HIF-PHD氧传感途径。

1.1 EPO 产生不足 REPCs 是成纤维细胞样间质细胞，分布在肾脏皮髓交界区肾小管周围间隙，该部位易缺氧，是肾脏感应机体氧饱和度的重要部位[8]。当发生肾损伤时，M2型巨噬细胞被募集以促进组织重塑；随后，趋化因子将炎性单核细胞募集到肾脏并活化为M1 型巨噬细胞，产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6，通过激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径，促使REPCs分化为肌成纤维细胞，而失去合成EPO 的能力，同时合成胶原蛋白，导致细胞外基质积聚，最终导致肾纤维化[8]。

肾脏纤维化使肾血流量减少，细胞减少耗氧以适应低氧环境，从而将组织O2分布改成“伪常氧”并维持正常的组织O2梯度，使PHD 保持酶活性[9]，因而无法形成稳定的HIF 以促进红细胞生成相关基因转录。而且CKD 患者的EPO 合成场所从肾脏向肝脏转化[10]。这些肾间质纤维化下发生转化的REPCs在适当的环境或通过稳定HIF 能可逆地恢复自身功能[11]，为CKD贫血治疗提供了一种方向。

1.2 铁缺乏 成红细胞合成血红蛋白（hemoglobin，Hb）及分化为成熟红细胞的过程依赖铁。研究显示，约有50%未接受ESAs 或铁剂的透析前CKD 贫血患者骨髓中铁已耗尽[12]。进行血液分析、透析患者血管通路外科手术和进行血液透析是CKD患者铁丢失的常见原因。因此，铁剂有助于治疗肾性贫血。在临床中，相比口服补铁，静脉注射铁剂能更好地纠正贫血[13]。这些研究提示铁代谢紊乱可能是肾性贫血另一重要发病机制。铁调素是一种降铁激素，通过结合十二指肠基底侧、肝细胞和巨噬细胞膜上铁转运蛋白（ferroportin，FPN；目前已知唯一的细胞铁输出蛋白，由SLC40A1基因编码）并诱导其泛素化降解使铁吸收和铁利用障碍[14]，引起功能性铁缺乏。而绝对或相对的铁缺乏被认为是导致EPO 抵抗的最主要原因[3]。研究显示，腺嘌呤诱导的CKD 小鼠成红细胞的早期分化模式与EPO基因敲除小鼠完全不同，成红细胞中TfR1表达降低以及循环中铁调素升高可能通过减少铁供应而阻碍红细胞分化，参与肾性贫血的发生[15]。HAMP基因（编码铁调素）敲除的腺嘌呤诱导的CKD小鼠未出现贫血和铁缺乏症且血清EPO水平升高[16]，表明铁调素升高可能是引起CKD贫血的原因之一。

1.3 炎症 CKD 在很大程度上被认为是一种炎症性疾病，与促炎细胞因子产生增加和清除减少、氧化应激、酸中毒、慢性和反复感染、脂肪代谢紊乱和肠道营养不良等相关[17]。CKD贫血患者IL-6、IL-1β、TNFα、IFN-γ、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和铁调素表达水平常显著升高[18]。IL-1β、TNF-α和IFN-γ抑制骨髓中成红细胞的增殖和分化；炎症诱发红细胞膜的脂质过氧化和促进巨噬细胞吞噬作用导致红细胞寿命缩短[17]。如前所述，炎症因子能促使REPCs分化为成肌成纤维细胞，而失去合成EPO 的能力。同时，炎症是引起EPO 抵抗的重要因素之一。目前认为，炎症引起的EPO 抵抗主要是通过上调铁调素介导的[19]。IL-6 通过IL-6/STAT3 途径和与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-SMAD 信号传导协同的方式激活铁调素基因表达[20]（详见下述），引起铁利用障碍。此外，IL-6 还能改变红细胞线粒体功能，抑制Hb合成，从而干扰红细胞生成[17]。

1.4 尿毒症毒素 CKD患者肾小球滤过能力下降导致UTs 蓄积。与蛋白结合的UTs，如硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）和对甲酚硫酸盐（p-cresyl sulfate，PCS），由于分子量较大，常规透析无法去除，是研究最多的代表性毒素[21]。研究显示，UTs（如神经酰胺、甲基乙二醛、IS和丙烯醛等）能诱导红细胞发生“红细胞衰亡”，致使红细胞被巨噬细胞识别、吞噬，迅速从循环血液中被清除[22]。IS 能激活芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR），抑制HIF活性，通过HIF依赖性方式抑制REPCs和肝细胞EPO 表达[23]。在细胞和动物模型的实验证明了IS能通过依赖于AhR和氧化应激/NF-κB 途径增强肝铁调素的表达[24]。但是该作用是否与IS对HIF的抑制有关仍需进一步研究。

2 铁调素参与介导肾性贫血中铁代谢紊乱

2.1 正常铁代谢 人体每日经食物补充铁1～2 mg，而由皮肤和肠细胞脱落丢失1～2 mg。为了维持正常红细胞生成和其它代谢活动，每日至少需要铁25 mg[25]。这部分铁主要由肝脾网状内皮系统的巨噬细胞清除衰老红细胞回收补充[25]。食物非血红素铁（Fe3+为主）在肠上皮细胞顶膜侧被十二指肠细胞色素B（duodenal cytochrome B，Dcytb）还原后通过二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）转运进入肠上皮细胞。当机体铁充足时，Fe2+结合铁蛋白并储存肠细胞内，随肠上皮细胞脱落排泄。当机体铁需求增加时，Fe2+通过基底膜侧FPN快速入血[该过程需要循环中的铜蓝蛋白（ceruloplasmin，Cp）和肠上皮细胞基底侧膜上亚铁氧化酶（hephaestin）协助将Fe2+氧化为Fe3+]并结合转铁蛋白（transferrin，Tf）形成带铁Tf（holo-Tf）进入血液循环[25]。在肝脾网状内皮系统中，Hb 在铁伴侣蛋白poly（rC）结 合 蛋白2[poly（rC）binding protein 2，PCBP2]协助下经血红素加氧酶1 分解释放出铁，随后通过FPN将Fe2+转运进入循环的[26]。在细胞内，部分铁与另一种铁伴侣蛋白PCBP1 结合，将铁传递至新合成的含铁蛋白，如PHD 和HIF1 抑制因子（factor inhibiting HIF1，FIH）和铁蛋白[26]。

2.2 铁调素及其表达调控 铁调素是肝细胞分泌的含25 个氨基酸的肽类激素，结构类似防御素，但杀菌作用很弱，通过降低血清铁浓度参与非特异性免疫防御（铁是绝大多数病原体生存的必须物质）。铁调素的靶蛋白是FPN，与其结合后激活JAK2，导致FPN 内吞、泛素化降解[27]。铁调素还可物理地阻塞FPN 的铁出口通道[28]。研究显示，HAMP基因缺陷小鼠FPN 稳定且肠道铁吸收和巨噬细胞铁释放增加[29]，同样结果在FPN 上C326S点突变小鼠（C326是FPN 胞外环上与铁调素结合的关键位点之一）观察到[30]。在生理条件下，铁调素的表达受到一群在肝脏表达的蛋白质调节，包括人血色素沉着病蛋白（human hemochromatosis protein，HFE）、TfR2、血幼素（hemojuvelin，HJV）、BMP6、matriptase-2和Tf。

循环中铁浓度的监测主要由TfR1、TfR2、HFE 和Holo-Tf 完成。HFE 由HFE基因编码，是一种主要组织相容性复合体I 类蛋白，是遗传性血色素沉着病（hereditary hemochromatosis，HH）最常见的突变类型，其特征是铁调素过低。HFE 在TfR1 上的结合位点与Holo-Tf重叠，当血清Holo-Tf升高时发生竞争性抑制，HFE从TfR1上移出，与特异性表达于肝细胞和造血前体细胞表面的TfR2 结合，招募HJV 并激活激活素受体样激酶3（activin receptor-like kinase 3，ALK3），通过BMP-SMAD 途径增强铁调素表达[31]。HJV 是由HFE2基因编码的糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）连锁膜蛋白，是BMP 家族的共受体，能与BMP2/4/5/6 结合增强BMP 通路的信号传导。BMP 是转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员，通过旁分泌调控铁调素表达。肝脏表达BMP2/4/5/6，但似乎只有BMP6与铁调素相关。BMP6基因缺失患者会出现严重的铁超载[32]。BMP6-HJV 与BMP I 型受体（ALK1、ALK2、ALK3 和ALK6）或BMP II 型受体[BMPR2 和ActR2A（activin receptor type 2A）]结 合 并 激 活SMAD1/5/8磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶受体，使SMAD4活化进入细胞核激活HAMP基因表达[25]。小鼠敲除HFE2基因会导致肝、胰和心脏铁沉积且铁调素的表达显著降低[33]。matriptase-2是TMPRSS6基因编码的丝氨酸蛋白酶，能将HJV 裂解成小片段减弱BMPSMAD途径信号，负向调节铁调素表达。TMPRSS6基因突变将导致遗传性铁剂难治性缺铁性贫血，患者由于对铁调素负性调节作用下降导致肠道铁吸收障碍[34]。在缺氧和铁缺乏症中观察到matriptase-2表达增加，表明在这些情况下有助于降低铁调素水平[35]。

实验用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激产生炎症的小鼠体内IL-6 和铁调素升高[36]。目前认为IL-6 在炎症引起的铁调素上调起重要作用。IL-6 和糖蛋白130 结合形成六聚体复合物，促使JAK1/2 磷酸化转录因子STAT3，活化的STAT3 易位至细胞核并与HAMP启动子近端的STAT3 反应元件结合，从而诱导铁调素转录[25]。其他炎症因子，如TNF-α、IL-10、IL-22、激活素B 等均与铁调素激活有关[26]。IL-10 和IL-22 可以激活靶细胞STAT3 信号通路从而诱导铁调素表达[37-38]。激活素B 能通过增加SMAD1/5/8信号传导通路的磷酸化来提高铁调素表达[39]。

贫血和红细胞生成活性增加时，铁调素的表达下调。目前认为，ERFE（erythroferrone）是促红细胞生成过程抑制铁调素表达的主要因子。ERFE 是补体C1q/TNF 相关蛋白家族的成员，由FAM132B基因编码。小鼠注射EPO 或放血导致应激性红细胞生成使脾脏和骨髓中成红细胞ERFE mRNA 表达增强，同时血清铁调素显著下降[40]。而且FAM132B基因敲除小鼠不能响应出血或注射EPO引起的铁调素抑制[40]，这表明EPO 通过ERFE 间接抑制铁调素表达。研究显示，EPO 与EPOR 结合后通过JAK2/STAT5 途径激活FAM132B基因表达，随后ERFE通过抑制BMP6，从而下调肝细胞BMP-SMAD信号抑制铁调素[41]。

2.3 铁调素与肾性贫血 前述可知，多种炎症因子（特别是IL-6、IL-10、IL-22 和激活素B）与CKD 贫血患者铁调素上调显著相关。同样的，腺嘌呤诱导的CKD 小鼠TNF-α 的水平显著升高[15]。TNF-α 能增加骨髓细胞中转录因子MafB 水平，后者能负向调节骨髓中表达TfR1 的成红细胞的数量[15]，红细胞TfR1 的表达下调可能直接增加肝铁调素的表达，减少红细胞的铁摄取，并阻碍红细胞的分化[42]。Nakanishi等[15]还观察到，CKD小鼠骨髓中的ERFE mRNA表达显著降低，这与EPO 缺乏有关，将导致EPO/ERFE 途径对铁调素的负性调控能力下降。铁调素分子量为2.7 kD，与血浆蛋白结合不牢，易通过肾脏排泄，大部分被近段小管吸收并降解，少部分随尿液排出[43]。随着CKD 的进展，肾小球滤过功能下降使铁调素在体内堆积。同样，炎症因子和UTs 也因蓄积并诱导铁调素的表达。在肾脏，肾间质白细胞产生的IL-6、TNF-α 通过BMP6-SMAD 途径诱导铁调素产生，这被证实对肾脏有保护作用[43]。研究显示，非透析CKD患者补充铁剂与铁调素升高相关[44]。因此，在CKD疾病进展中多种因素共同导致循环中铁调素升高。

肠上皮细胞DMT1（经铁调素介导的泛素依赖的蛋白酶体途径降解）和FPN 在铁调素诱导下降解使肠道铁吸收和铁输出受阻[45]；肝脾网状内皮系统的巨噬细胞吞噬Hb 回收的铁输出受阻。这些情况使循环中可利用铁减少，即使铁储充足也无法满足红细胞生成的需要，导致“功能性铁缺乏“。一项大规模人群的横断面研究显示，即使补充铁剂，铁调素水平较高的患者由于铁利用障碍，仍需要更高剂量的ESAs 治疗[44]。而经血液透析滤过铁调素能显著改善CDK患者的EPO抵抗[46]。

生理条件下，原尿滤过的Holo-Tf 几乎在近端肾小管通过TfR1、megalin-cubilin 受体复合物和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白受体介导的内吞作用重吸收，在胞质二价金属转运蛋白（ZIP8、ZIP14 和DMT1）协助下从内体释放，然后从基底侧细胞膜上FPN 进入血液[47]。循环铁调素和肾脏局部铁调素升高导致肾小管FPN 降解并下调DMT1 使铁输出受阻引发肾脏铁沉积[43，48]。铁沉积会降低REPCs 中HIF-2α 浓度使EPO 产生减少，随着EPO 减少又加重肾性贫血和肾脏铁沉积，形成恶性循环[49]。

3 HIF对铁调素调控与、稳态

目前已克隆出3 种HIF-α，即HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α（分别由HIF1A、EPAS1和HIF3A基因编码），属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）-Per-ARNT-Sim（bHLH-PAS）家族，能与HIF-1β 结合形成异二聚体，形成HIF1、HIF2 和HIF3[6]。HIF-α 含2 个高度保守的氧依赖性降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）[50]，其活性受PHD 和FIH调节。常氧条件下，HIF-α 的T1/2仅为5 min，其ODD氨基酸序列上的脯氨酸（P402 和P564）被PHD 羟基化后结合von hippel-lindau（VHL）肿瘤抑制蛋白（pVHL），后者招募E3 泛素连接酶将其携带至蛋白酶体泛素化降解[6]。PHD 有3 种同工酶（PHD-1、PHD-2 和PHD-3，其活性必须有分子氧（O2）、Fe2+、抗坏血酸和α-酮戊二酸（2-oxoglutarate，2-OG），其中2-OG 为底物，铁为辅因子[51]。在缺氧缺铁条件下，PHD 活性下降，HIF-α 蓄积，与HIF-1β 二聚化生成HIF并募集转录辅因子（转录辅激活因子和组蛋白乙酰转移酶p300/CBP），随后结合靶基因上缺氧反应元件（hypoxic response element，HRE）的特定序列，从而促进靶基因的转录。HIF-1α 在体内广泛分布，参与代谢调节、血管形成、细胞凋亡、氧化应激和其他生物过程[6]。相比HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α的分布具有组织特异性。HIF-2α 在REPC、内皮细胞和肠上皮细胞高度表达，主要参与促进铁吸收和诱导EPO 产生提高机体的缺氧耐受性[51]。目前对HIF-3α了解甚少，可能与HIF-1α和HIF-2α的负调控有关。

3.1 HIF-2α与肠道铁吸收 缺铁或缺氧时，观察到十二指肠上皮细胞中DMT1、Dyctb 和FPN 表达高度上调。Shah 等[52]在肠道特异性pVHL基因敲除和pVHL基因及HIF1A基因均敲除的小鼠模型中观察到大量HIF-2α 被诱导，且DCYTB基因和DMT1基因在十二指肠中高度激活，提示Dcytb和DMT1基因均受HIF-2α 转录调控且该作用是由于HIF-2α 而非HIF-1α 引起的。低铁诱导的FPN 表达在EPAS1基因敲除小鼠中完全消失，并且在长期缺铁情况下FPN mRNA 以HIF-2α 依赖的方式增加[53]。最近研究显示，应用HIF-PHI 药物（Roxadustat）能通过抑制PHD以稳定HIF-2 来促进肠细胞中Dcytb、DMT1 和FPN的表达以拮抗铁调素的作用，增强肠道铁吸收[17]。

3.2 HIF与铁调素 缺铁性贫血患者铁调素水平较健康者显著下降。Peyssonnaux 等[54]研究显示，缺铁小鼠的肝脏内HIF-1α 水平显著升高，表明缺铁会影响肝脏中HIF-1α 的表达；缺铁饮食且肝细胞HIF1A基因敲除小鼠与普通小鼠相比，其体内铁调素升高10 倍，说明HIF-1α 抑制了铁调素表达。HAMP基因上有3 个HRE 结合位点且PHD 是铁依赖性酶，缺铁或缺氧能使PHD 活性下降，肝内HIF1 稳定并结合HAMP启动子上HRE，从而抑制铁调素表达[54-55]。肝特异性pVHL基因敲除小鼠体内铁调素水平显著下降，而HIF-1α 和FPN 表达增加[56]，表明HIF-1α 参与肝内铁调素的调节。Schwartz 等[57]描述了铁调素/FPN 轴稳定HIF-2α 对肠道的重要性，在肝细胞HAMP基因敲除的小鼠模型中，十二指肠上皮细胞FPN和血清铁增加，FPN增加使肠上皮细胞内铁浓度下降，HIF-2α 不被PHD 羟基化降解，从而诱导铁吸收相关基因（DMT1、Dcytb和SLC40A1）连续转录；同时在诱导型特异性SLC40A1基因和DMT1基因敲除小鼠模型和体外细胞实验中证实FPN 介导的铁外流以细胞自主方式触发HIF-2α 的稳定。而使用HIF-2拮抗剂可以减轻铁调素缺乏小鼠的中的铁蓄积[58]。

在REPCs 中HIF-2α 能与EPO基因启动子HRE结合促进EPO 的产生，促进红细胞生成。这个过程会通过EPO/ERFE 途径抑制铁调素表达[55]。应用Roxadustat 治疗肾性贫血能观察到显著的EPO 诱导和铁调素下调证实了这一点[59]。骨髓中血小板源性生 长 因 子BB（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）是HIF-1α 的靶标，能够在低氧中通过环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）/H 途径抑制铁调素[60]。此外，体外细胞研究显示HIF-1α 通过增加弗林蛋白酶（furin）mRNA 可将铁HJV 剪切成可溶性片段，后者竞争性结合BMP6，直接阻断下游铁调素的转录通路[61]。HIF-1 还能与TMPRSS6启动子区域中的HRE结合上调matriptase-2[35]，后者能强烈地抑制铁调素。

炎症是引起铁调素上调的关键因素。在顺铂诱发的肾脏损伤中，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性细胞因子显着增加，Roxadustat 治疗能显著减少这些炎性因子[62]。在小鼠实验中也证实HIF 能降低IL-10 和IL-22使铁调素维持在较低水平[63]。

最近开发的小分子口服药物HIF-PHI 主要包括Roxadustat（FG-4592）、Vadadustat（AKB-6548）、Daprodustat（GSK-1278863）、Molidustat（BAY85-3934）、Enarodustat（JTZ-951）和Desidustat（ZYAN1），其中Roxadustat 已在我国上市，其它药物还处于临床研究阶段。临床研究显示这些药物能有效升高EPO 和Hb 水平，降低血清铁调素并改善EPO 抵抗，达到治疗肾性贫血的目的[59，64]，具有非常广阔的前景。

4 结语

越来越多的证据表明铁调素升高引起的功能性铁缺乏是引起CKD 贫血及治疗过程中出现EPO 抵抗的原因。靶向抑制铁调素为治疗肾性贫血提供了一种新的思路。而HIF 稳定后能与铁调素基因上HRE 结合直接抑制铁调素表达，还能调控铁调素激活过程的多个分子间接抑制铁调素表达，同时增强肠道铁吸收相关基因的表达，改善铁代谢紊乱。稳定HIF 的药物HIF-PHI相较传统ESAs和铁剂治疗更符合人体生理，在临床中显示出广阔的前景。总之，研究HIF 对铁代谢的调节有助于更好地了解肾性贫血的病理生理机制及HIF-PHI 的药理毒理作用。但是HIF 的靶点众多，特别是与肿瘤相关[65]，而现有HIF-PHI特异性不强，需进行更多的临床试验评估其安全性和有效性。