肾上腺素受体介导ROS产生的分子机制*

陈显达， 张幼怡， 肖 晗

（北京大学第三医院心内科、血管医学研究所，国家卫生健康委心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室，北京100191）

交感肾上腺素系统过度激活是高血压、冠心病、房颤和心衰等多种心血管疾病发生发展的重要病理因素。近年来，越来越多的研究发现，交感应激常导致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生增加。在生理情况下，ROS 在调节心脏发育、心肌细胞成熟、钙离子流、兴奋-收缩偶联和血管张力方面发挥重要作用[1]。而在病理情况下，ROS 生成或代谢失控，引起ROS 水平升高，进而导致DNA、蛋白质和脂类发生氧化损伤，线粒体通透性转换孔激活，线粒体功能障碍，乃至细胞死亡[2]。因此，过多ROS 的产生是心肌肥厚、心脏缺血再灌注损伤和糖尿病心肌病等病理性心脏重构和心力衰竭进展的关键因素之一[3-6]。本综述主要关注交感肾上腺素系统对心血管系统ROS 产生调控机制的研究进展，以期为心血管疾病的防治提供新思路。

1 ROS的产生

ROS包括超氧阴离子（·O2-）、羟自由基和过氧化氢（H2O2），是细胞呼吸和新陈代谢的副产物，或由专门参与氧化还原信号的酶产生。心血管系统ROS的来源主要包括线粒体电子传递链（electron transport chain，ETC）、线粒体和胞质中的某些代谢酶，如线粒体单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、环加氧酶（cyclooxygenase，COX）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）等，以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）。鉴于ROS 信号在心脏生理和疾病中的重要作用，ROS 信号必须受到严格的调控来维持细胞内氧化还原的稳态，以确保ROS信号发挥生理作用而不导致病理效应。细胞内ROS水平由一系列复杂的抗氧化物控制，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）/还原酶系统和过氧化物氧还蛋白（peroxiredoxin，Prx）/硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）系统，这些系统参与ROS 清除。当ROS 的产生量超过内源性清除能力时，就会导致细胞内ROS 蓄积。因此，与ROS产生过多类似，细胞清除ROS能力受损也会导致心脏功能障碍[7-10]。

2 肾上腺素受体（adrenergic receptor，AR）

有研究发现AR 可介导交感过度激活引起的细胞ROS 生成[11-14]。交感应激时，神经递质儿茶酚胺通过与特定的肾上腺素受体结合来发挥作用。根据对激动剂及拮抗剂的亲和力、所介导的信号通路和氨基酸序列的差异性，可将AR分为α1、α2和β三类。

α1-AR 激动时主要通过Gq/11蛋白激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），PLC 促进磷脂酰肌醇4，5-双磷酸（phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2）水解产生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）与二酰基甘油（diacylglycerol，DAG），DAG 继而激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），调控钙通道释放钙离子，介导平滑肌细胞收缩。α2-AR主要分布在血管的交感神经节后纤维的突触前膜和后膜，通过与Gi蛋白偶联使腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）活性降低，环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）生成减少，cAMP 依赖性蛋白激酶活性降低，引起平滑肌细胞的收缩。

β-AR 可以与Gs和Gi蛋白偶联，此外也介导非G蛋白依赖的β-arrestin 信号通路。β1-AR 激动时主要通过偶联Gs蛋白使AC 激活，cAMP 依赖性蛋白激酶激活，导致心肌细胞和血管平滑肌细胞L 型钙通道的开放，钙离子内流的增加，继而引起心脏正性变力、正性变时作用和血管平滑肌舒张。

目前认为AR 激动能够调控线粒体来源（包括线粒体呼吸链、线粒体融合分裂和线粒体MAO）及NOX 来源的ROS。另外，AR 还能通过抑制抗氧化系统下调ROS 的清除能力，导致ROS 蓄积。下面我们将从上述3 个方面对AR 调控心血管系统ROS 产生的机制进行综述（图1）。

3 AR介导线粒体来源的ROS

3.1 线粒体ETC 在机体内，线粒体呼吸链是能量生产的中心。它具有偶联呼吸链复合物之间电子转移和线粒体内膜上质子运输的功能，以产生合成ATP 所必需的电化学梯度。在氧消耗和ATP 产生之间，电子向下传递通常不是完全偶联的。因此，一小部分（＜0.1%）电子可以从ETC 中泄漏，有一部分O2被还原，形成或H2O2。其中，最为重要的是它是大部分ROS 的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的酶复合体I、III产生。

生理状态下，β-AR 激动通过经典的Gs/AC/cAMP/PKA通路发挥正性肌力作用，促进线粒体三羧酸循环、氧化呼吸增强和耗氧增多，导致更多的电子通过ETC 泄漏到线粒体内外膜间隙，故线粒体ROS产生增多。蓄积的ROS 最终扩散到胞质中，作为信号分子发挥氧化作用[15]。病理情况下，持续激活的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）能使多种参与胞内钙离子调控的关键分子发生磷酸化，包括L 型钙通道（L-type calcium channel，LTCC）、雷诺丁受体（ryanodine receptor，RyR）、受磷蛋白（phospholamban，PLN）和肌浆/内质网Ca2+-ATP 酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）[15-20]，进而导致胞内钙超载，线粒体膜上钙离子单向转运体（mitochondrial calcium uniporter，MCU）摄取的钙离子增多而使线粒体内钙离子浓度异常升高，线粒体内膜两侧电势差（mitochondrial membrane potential，MMP）升高，线粒体功能异常，产生的ROS 增多[21-23]。Theccanat 等[24]的研究发现，β-AR 激动所引起的ROS 产生增多并不完全依赖于PKA通路，可见β-AR激动导致ROS产生增多还存在别的机制。本课题组前期研究发现，急性β-AR 激动导致ROS 的产生分2 个阶段，分别是早期阶段（10～15 min）和延迟阶段（90～120 min）。在新生小鼠原代心肌细胞中，β-AR 激动的早期（15 min），线粒体ROS 的产生依赖于cAMP/PKA 通路；而延迟期（2 h）则由非经典的G 蛋白偶联受 体 激 酶2（G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2）/β-arrestin-1/NOX4 通路介导，且早期ROS 的产生以线粒体为主而不是胞浆NOX来源[25-26]。

3.2 线粒体分裂 线粒体在哺乳动物细胞中是一种动态变化的细胞器。随着各种刺激和代谢的需要，线粒体的形状、大小、数量和位置不断变化。线粒体分裂和融合的平衡决定了线粒体的形状，这也是维持线粒体和细胞功能的关键。线粒体通过不断的分裂融合过程维持自身稳定，分裂会使线粒体碎片化，而融合则促进线粒体形成管网状结构。在病理和不利因素作用下，线粒体过度分裂，发生碎片化，ETC 遭到破坏，导致大量电子漏出和ROS 产生。而线粒体融合增强可提高呼吸链相关蛋白活性，修复损伤线粒体，降低氧化应激水平[13]。有研究发现，AR 可以通过影响线粒体分裂和融合蛋白的活动进而调节线粒体ROS 的生成[27]。苯肾上腺素（phenylephrine，PE）特异性激动大鼠原代心肌细胞的α1-AR后，Gq/蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）通路激活，PKD 由胞质转移到线粒体外膜上，使线粒体发动蛋白样蛋白1（dynamin-like protein 1，DLP1）第616 位和第637 位丝氨酸发生磷酸化，随后磷酸化的DLP1 转移至线粒体内，线粒体分裂，引起线粒体膜孔开放增多、产生的ROS增多和呼吸增强，并激活凋亡[13]。此外，这2 个位点同时也受β-AR 调控。β1-AR 可分别通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）和PKA通路使得DLP1第616位和第637位丝氨酸磷酸化；β2-AR 可通过蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）和PKA/钙 调 磷 酸酶（calcineurin，CaN）分别使DLP1 第616 位和第637 位丝氨酸磷酸化，随后转移到线粒体外膜，进而线粒体发生分裂，产能增多的同时ROS 产生也增多[27-28]。由此可见，DLP1 的这2 个丝氨酸位点与线粒体分裂密切相关，且其磷酸化受AR的调控。

3.3 MAO MAO 存在于线粒体外膜，负责儿茶酚胺（如肾上腺素、多巴胺和血清素）氧化脱氨的同时，还能产生H2O2、NH4+和活性醛。MAO 有A 亚型和B亚型（MAO-A 和MAO-B）之分，是线粒体H2O2的重要来源之一。Kaludercic 等[29]的研究证实，用去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）刺激分离培养的新生和成年小鼠心肌细胞时，MAO-A 被激活，随后心肌细胞体积变大，ROS 产生增多，并表现为心肌细胞肥大。所有这些离体细胞的表型不完全依赖于α-AR 和β-AR 信号通路，并且可被MAO-A 的抑制剂氯己定（clorgyline）抑制。在压力超负荷导致左室扩张和心力衰竭的小鼠模型中，MAO-A 对NE 的分解代谢增强并伴有氧化应激加重。提示AR 可能通过激活线粒体外膜上的MAO-A 促进ROS 生成，但是具体分子机制仍有待研究。MAO-B 的作用与MAO-A 相似，在人和小鼠的心脏中均有表达。有研究称MAO-B 敲除可以改善由压力负荷诱导的心衰[30]，但是关于肾上腺素受体激动与MAO-B的关系尚未见报道。

4 AR调控NOX来源的ROS

除了线粒体，ROS 的另一个重要来源是分布于质膜和多种细胞器膜上的NOX。NOX 家族共有7 个成员，即NOX1～5 型及Duox1 和2 型，是一类参与细胞内ROS生成的酶，能催化NADPH 的电子向分子氧转移，生成超氧化物和过氧化氢[31]。NOX 由2 个与膜相关的催化亚基（NOX 和p22phox）和3 个细胞质调节亚基p47phox、p67phox和p40phox组成。鉴于NOX2 是第一个被发现的NOX 亚型，并且对其激活机制的研究比较丰富，以下我们就以NOX2 亚型为例对NOX 的激活过程进行阐述。静息状态下，NOX2和p22phox（也被称为细胞色素b-245轻链）共同构成未激活复合物定位于细胞膜上，而p40phox（也被称为中性粒细胞胞质因子4）、p67phox（也被称为中性粒细胞胞质因子2）和p47phox（也被称为中性粒细胞胞质因子1）则位于细胞质内。此外，NOX2 完全激活还需要与小GTPase p21-RAC1（也被称为Ras 相关的C3 肉毒毒素底物1）在膜上进行组装。当NOX2激活时，RAC1被募集到胞膜上，p47phox被PKC 磷酸化并与p67phox和p40phox一起转运到膜上。由于p47phox发生磷酸化改变了其构象，使得p47phox的Src 同源结构域SH3 可以结合到p22phox胞质侧碳端富含脯氨酸的区域上，实现了NOX2的激活[31]。

心肌细胞和血管内皮细胞表达NOX1、NOX2、NOX4 和NOX5 这4 种亚型，血管平滑肌细胞表达NOX1、NOX4和NOX5这3种亚型[31]。目前已知的受AR 调控的亚型主要是NOX2 和NOX4。尽管它们的结构相似，但二者存在明显的差异。例如，NOX2 需要胞质中的一些调节亚基才能激活，而NOX4 则不需要。NOX2 和NOX4 在不同的细胞类型中有不同的亚细胞定位。一般来说，NOX2 主要定位于质膜，而NOX4 则主要定位于细胞内膜，包括线粒体、内质网和细胞核膜。多种细胞外刺激通过细胞内第二信使使NOX2 快速激活。而NOX4 是持续性激活的，其活性主要与表达量相关，受其表达水平的调控[32]。但是，也有研究发现，在血管平滑肌中，NOX4/p22phox复合体活性受聚合酶δ 相互作用蛋白2（polymerase δ-interacting protein 2，POLDIP2）的调控，后者能与NOX4/p22phox相互作用并提高NOX4 的活性，从而介导ROS 的产生和Rho 依赖的细胞骨架重塑及细胞迁移[33]。

在成年大鼠心肌细胞中，特异性激动α1-AR 后，产生的ROS明显增多，并激活了下游的Ras-MEK1/2-ERK1/2 通路，导致心肌肥大。增多的ROS 只能被NOX 的抑制剂[二苯多铵、氧化苯胂、4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟和镉]抑制，而不受线粒体ETC、NOS、XO 和COX 的抑制剂的影响[34]。这提示心肌细胞α1-AR 激动引起的ROS 产生主要来自NOX。Matsushima 等[35]用PE 特异性激动小鼠心肌细胞的α1-AR，发现NOX4 的表达水平呈剂量依赖性上调。进一步研究发现，α1-AR激动会通过核膜上的NOX4引起核内ROS 产生增多，最终导致心肌肥厚。而在主动脉血管平滑肌细胞中，α1-AR 长时间（大于4 h）激动会通过NOX 引起ROS 产生过多并导致细胞凋亡[36]。Tsai等[37]用NE 处理内皮剥脱的大鼠尾动脉，发现NE 激动α1-AR后能激活NOX产生大量ROS，并通过RhoA/Rho 激酶依赖途径改变肌球蛋白磷酸酶介导的肌球蛋白轻链20 磷酸化，进而促进血管平滑肌收缩。NOX2 被激活后，产生的ROS（尤其是H2O2）会激活原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，导致表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）转激活和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）依赖的RAC1 活化；RAC1 作为NOX2 的亚基之一，它的活化能增强NOX2 的活性，进一步放大NOX2的激活[31]。

β-AR 激动除了通过上述经典的cAMP/PKA 通路引起线粒体ROS产生增多外，还能通过上调NOX4的表达来促进ROS产生[24，38]。Theccanat等[24]的研究发现，用异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）刺激H9c2心肌细胞会引起NOX4 表达升高（NOX2 表达水平无明显变化），提示NOX4 是β-AR 激动后线粒体产生ROS 的主要来源之一。进一步研究发现，ISO 引起的NOX4 表达水平升高不通过经典β1-AR/cAMP/PKA 通路，而是由β1-AR/GRK2/β-arrestin 通路介导。如果敲减GRK2的表达，或是使用了NOX4的干扰RNA 后，β-AR 激动所引起的ROS 增多受到抑制；而使用β-arrestin 过表达腺病毒则促进ISO 引起的ROS产生增多。Saleem 等[12]的研究发现，用AR 激动剂NE（能同时激动α-和β-AR）处理大鼠心肌细胞系H9c2，短时间（10 min）内产生的ROS 主要来自被激活的NOX2，且ROS 定位于胞浆和内质网，而不是线粒体。

上述研究提示，α1-AR 激动可以通过激活质膜上的NOX2促进胞质ROS的生成。此外，α1-AR激动还可引起核膜NOX4 表达水平升高促进细胞核内ROS产生增多，诱导心肌细胞肥大。而β1-AR激动则导致线粒体内膜上的NOX4 表达水平升高进而促进线粒体ROS的生成增多。目前尚未发现直接证据证明β1-AR激动能够增强NOX2活性来促进ROS产生。

5 AR调控抗氧化系统

为了防止ROS 的积累，心肌细胞具有小到ROS清除剂，大到结构复杂的抗氧化酶共同组成的抗氧化系统[39]，包括SOD、CAT、GPx 和Prx/Trx 系统等。NADH 是在三羧酸循环过程中产生的一类重要的抗氧化分子。在生理条件下，线粒体烟酰胺核苷酸转氢酶（nicotinamide nucleotide transhydrogenase，NNT）催化NADH+NADP+→NADPH+NAD+的反应，增强NADPH 依赖性的抗氧化能力，以清除氧化磷酸化过程中产生的ROS。而在心脏病理性超负荷期间，该反应发生逆转（NADPH+NAD+→NADH+NADP+），以牺牲NADPH 依赖的抗氧化能力为代价，再生NADH来维持ATP的供应。

当β-AR 激动发挥正性肌力作用时，高负荷工作的心肌依赖线粒体呼吸来维持足够的能量供应。随着工作负荷的增加，ATP 水解速率的提高会刺激氧化磷酸化，从而通过ETC 加速线粒体NADH 氧化和电子传递。因此，从ETC 中漏出的单电子率更高，产生的ROS 增多。与此同时，为了产生更多的ATP 而大量消耗NADH 和NADPH，从而线粒体的抗氧化防御系统被削弱。Srivastava 等[40]的研究发现，ISO 能通过β1-AR 使心肌细胞抗氧化能力明显减弱，包括使SOD1（即copper/zinc SOD，Cu/Zn-SOD）活性及其mRNA 和蛋白水平下降，使正性调控SOD 表达的转录因子Elk-1 减少，负性调控因子YY-1 增多，但是对于SOD2（即manganese SOD，Mn-SOD）、CAT 和GPx无明显影响。

6 小结

大量研究表明，AR 激动引起的ROS 产生过多是心血管疾病病理生理过程中的重要环节。在心血管疾病的发病过程中，ROS由多种来源产生，主要是线粒体氧化呼吸链和NOX。但是，AR 对不同ROS产生系统的调控机制尚不十分明确。因此，对AR 调控ROS产生机制的进一步探究将为心血管疾病的发生发展提供新的见解，如AR 激活调控线粒体MAO和NOX 的分子机制。选择性靶向特定的关键分子，如不同亚型的NOX 或MAO-A 以纠正线粒体功能障碍，从而抑制ROS产生，可能是一种用于治疗各种心血管疾病的非常有益的新策略。