天冬酰胺内肽酶与创伤性脑损伤相关的阿尔茨海默病*

刘 易， 丁 怡， 刘 蓉， 王建枝，3， 柯 丹△， 王小川，3

（1华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系，湖北武汉430030；2潍坊医学院基础医学院病理生理学系，山东潍坊261053；3南通大学神经再生协同创新中心，江苏南通226001）

1 创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的概况

TBI 在全球意外伤害的死亡和伤残原因中居首位，带来了诸多经济、医疗等社会问题。实际上，全世界每年有1 000 万人死亡和就医直接归因于TBI，大约有5 700 万人患有脑损伤相关疾病[1]。TBI 的幸存者会出现有多种病理现象，例如神经功能缺损，短期和长期脑损伤，认知、行为和情感障碍，所有这些都取决于损伤的严重程度。从功能成像研究中可以明显看出，认知方面的神经系统缺陷是由于海马萎缩和白质束受损所致[2]。TBI 可根据其严重程度和作用机制进行分类[3]。在动物模型中，通过复制轻、中、重度不同程度的TBI，观察导致其结果恶化的临床因素对于疾病病理和治疗的理解至关重要。

TBI能导致脑肿胀、轴突损伤和缺氧，破坏血脑屏障功能，增加炎症反应、氧化应激和神经变性，并导致认知障碍[4]。尽管许多患者在最初的伤害中幸存了下来，但TBI 是一种慢性疾病过程，最终可能导致他们几个月甚至几年后的死亡[5]。TBI后的细胞死亡是神经功能缺损和死亡的主要原因[6]。TBI的发生是一种初始损伤引起生化和细胞变化的疾病过程，这些变化最终会导致神经元的持续损伤和死亡。这种持续的损伤被称为继发性损伤，多种凋亡和炎性途径在这一过程中被激活[7]。脑损伤后的脑环境状态以及由此产生的继发性脑损伤决定了患者最终的结果。

头部创伤导致的脑损伤一般分为两类：急性脑损伤包括轻度TBI 或脑震荡，包括其短期后遗症和可能导致死亡的灾难性脑损伤，最常见的原因是硬膜下血肿；慢性脑损伤又称慢性创伤性脑病（chronic traumatic encephalopathy，CTE），是由反复头部创伤导致的神经退行性疾病，多出现在专业拳击手和其他接触性体育运动员身上，经常在其运动生涯结束后几年开始。

2 TBI与阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）

TBI是老年人群中的一个常见现象，因为老年而进一步影响其预后。目前，65 岁以上的TBI 病例增加了21%。众所周知，老年创伤患者的预后很差，康复情况不容乐观，死亡率和功能残疾率是年轻患者的2 倍。多达65%的中度至重度TBI 患者呈现不同程度的认知功能障碍[8]。Luukinen 等[9]的研究提示，严重颅脑损伤的发生增加了认知能力底下的风险，与没有TBI的老年人相比，TBI老年患者认知功能减退的趋势明显加快。因此，TBI 与年龄相关的大脑变化进一步加剧认知功能障碍。

AD 是一种多因素神经退行性疾病，涉及多种不同的致病机制，存在多种高风险因素，其病因目前尚未得到充分了解。TBI 可能是AD 诱发因素[10]，其特征包括多个大脑区域的神经元中存在AD 关键发病分子tau 蛋白异常过度磷酸化[11]。同时，AD 的另一分子标志物β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）亦在部分TBI急性死亡患者中被发现[12]。因此，TBI与AD之间相互关系及潜在发生机制亟需阐明。

2.1 TBI 与tau 蛋白 tau 蛋白是微管相关蛋白家族的成员，主要功能受到磷酸化的严格调控[13]。然而，因相关蛋白激酶激活和（或）蛋白磷酸酯酶活性下调，tau 蛋白异常过度磷酸化，并在几种神经退行性疾病中异常聚集，这些疾病被统称为tau 蛋白病[14]。最典型的tau 聚集体发生在AD 中，其中异常过度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs），在神经元内形成聚集体。作为AD 大脑两大标志性病变之一的NFTs 也是其它神经退行性疾病的特征性病理特征，最近已在CTE 患者的大脑中发现了NFTs。但是，通常直到受伤后数月或数年才在TBI中观察到由异常过度磷酸化tau蛋白组成的NFTs[15]。引发CTE 中tau 蛋白病变的神经化学变化尚不清楚，但最近的研究表明TBI 诱导异常的轴突内激活和激酶积累，可以促进tau 蛋白磷酸化[16]。Tran 等[17]发现脑外伤可增强tau 蛋白的免疫反应性和tau 蛋白磷酸化，且这些异常变化与TBI 严重程度呈正相关。

tau 蛋白沉积与AD 临床症状的进展亦呈现正相关[18]。Mohamed 等[19]的研究表明，与对照组相比，TBI 受试者大脑皮层中tau 蛋白沉积增多（10%～20%），其可能机制涉及TBI 促进剪切力对轴突细胞骨架造成物理损伤，进而使结合异常的tau 蛋白成核，促进NFTs的形成[20]；另一种可能的机制是TBI引起血脑屏障损伤，促进tau 蛋白积聚，从而诱导NFTs形成，通常在聚集于脑沟深处，特别是在皮质小血管周围，最终可能导致CTE[21]。

TBI 后tau 蛋白病变发展的分子机制尚不清楚。由于tau 蛋白的磷酸化状态受tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡调节控制，TBI 后tau 蛋白病变机制的另外一种可能是tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡失调[1]。Mouzon 等[22]在模拟TBI 的啮齿动物模型中发现，造成损伤2～3 个月后，总tau 蛋白水平和NFTs 显著增加，并伴有白质降解和神经炎症增加。因此，TBI 诱发AD 等一系列神经退行性病变的本质使人们相信，tau蛋白异常过度磷酸化是TBI相关AD的关键病变。

2.2 TBI 与Aβ Aβ 聚集形成的老年 斑（senile plaque，SP）是AD 的另一大病理特征[23]。Aβ 由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而成。

流行病学研究表明，死于TBI 的患者中，有30%的脑中存在Aβ斑块[24]。免疫组织化学分析显示，TBI促进受损的轴突中积累Aβ 裂解所需的酶。Chen等[25]在猪弥漫性轴突损伤模型和人TBI 患者的轴突肿胀中都发现了γ-分泌酶1 和β-分泌酶。这些研究均提示TBI可能引起Aβ毒性。APP具有神经营养功能，包括促进轴突发芽、神经突向外生长和突触发生，这对轴突损伤后的神经元存活非常重要。Thornton等[26]研究发现，APP因脑损伤而上调，而上调α-分泌酶可竞争性阻止β-分泌酶剪切APP，减少Aβ产生，从而减少动物实验性TBI 后神经元丢失和轴索损伤。对人脑组织样本的研究表明，在脑损伤后神经元和轴突中APP 累积将导致轴突损伤[27]。对患有轻度TBI但死于其他原因的患者的脑组织样本进行的死后研究表明，这种APP积累可非常迅速地（在几小时内）发生，并且能够存在于轻度创伤的情况下[28]。具有AD样病变的APP转基因小鼠在6 月龄时形成淀粉样斑块，这些动物TBI后导致Aβ水平显著升高，尤其是在海马中。与未受伤的对照组相比，TBI 转基因小鼠Aβ 的高度聚集使海马神经元损伤严重，与脑损伤的野生型小鼠相比，海马神经元的损伤也很严重[29]。这些研究提示TBI进一步促进AD的病理变化。

3 天冬酰胺内肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）与AD

AEP 也称为δ-分泌酶或legumain（LGMN）。哺乳动物的AEP 是溶酶体半胱氨酸蛋白酶，可在天冬酰胺残基后特异性切割其底物。在人类中，AEP 由位于染色体14q32.12上的LGMN基因编码。与半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶相似，初合成的AEP 为含有C 和N 末端前肽的无活性酶原[30]。晶体结构显示，C端前结构域覆盖半胱天冬酶样AEP 酶核心，并禁止底物接近该酶核心，从而阻止其酶促活性；在酸性条件下，其N 端和C 端片段自我裂解，其酶活性被激活[31-32]。因此，AEP 的酶活性受到pH 值严格调节[33]。癌症和AD 的环境往往呈弱酸性，在这样的病理条件下，AEP 将被激活。此外，AEP 的酶活性也受其他因素调节。例如，当αVβ3整合素存在时，pH最佳值从5.5 升至6.0[32]。神经元中AEP 存在翻译后修饰，Akt 可磷酸化AEP 的T322 位点，从而抑制APP 自动裂解和酶促反应。在tau P301S 小鼠脑中，过表达模拟磷酸化AEP T322E 突变体可显著抑制AEP 的活性，减弱tau 蛋白病变，减轻病理和认知缺陷。Akt 激活受脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/原肌球蛋白受体激酶B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）信号通路调节，BDNF 的减少会减弱AEP T322 位点的磷酸化，引起AEP 的胞浆滞留和激活[34]。也有研究显示，用TrkB 激动剂可抑制AEP 的活化以及APP 和tau 蛋白的病理性切割，从而减轻AD病变和行为学异常[35]。

3.1 AEP 与tau 蛋白 有报道显示，在AD 患者大脑中，AEP 活性上调，且存在AEP 剪切的tau 蛋白片段tau1-368。体内和体外研究结构均表明，AEP 在N368后裂解tau 蛋白，产生tau1-368片段。与全长tau 蛋白相比，该片段更易于磷酸化，并丧失其微管组装活性[36]。tau1-368片段与BDNF 同源受体TrkB 结合，阻断神经营养信号，从而诱导神经元死亡[37]。另外，AEP活性和tau 蛋白裂解呈年龄依赖性增加[36]。因此，AEP可能在AD发病机理中起关键作用。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是tau 磷酸化主要的调节因子，PP2A 的抑制改变磷酸化和去磷酸化之间的平衡，进而导致tau 蛋白磷酸化增加。SET（SE translocation）是一种多功能蛋白质，能够通过与PP2A 催化亚基PP2Ac 相互作用而有效地抑制PP2A 活性，因此亦被称为I2PP2A（inhibitor 2 of PP2A）[38]。在正常状态下，SET 蛋白以二聚体的形式聚集于核中。但I2PP2A/SET在其N175处切割成NTF和CTF 末端片段后易位至细胞质。这两个片段都能够有效抑制PP2A，从而促进tau 蛋白的过度磷酸化，而SET 的CTF 过度表达可引起AD 病变和认知障碍，表明SET 的切割可以在动物模型中引发AD[39-40]。在AD大脑中，AEP能通过溶酶体转移到细胞质或细胞核并切割SET[41]。

3.2 AEP 与Aβ Aβ 是由β-和γ-分泌酶对跨膜蛋白APP 进行顺序水解切割而产生的。β-分泌酶裂解APP产生C端C99片段，此片段被γ-分泌酶进一步裂解并产生Aβ。另外，APP 可以被Aβ 序列中的α-分泌酶切割，从而阻止了Aβ 的产生[42]。除α-、β-和γ-分泌酶外，研究者还鉴定出其他蛋白酶可裂解APP并调节其生理及病理功能[43-44]。例如，APP 经η-分泌酶加工会产生抑制海马神经元活性的片段[44]。

研究发现AEP 表达水平以年龄相关的方式升高，并与老年大脑中的APP 片段紧密相关。值得注意的是，与健康对照组相比，AD 患者大脑中APP 裂解显著增加。在5XFAD 小鼠模型中，AEP 的酶活性升高，且AEP 剪切生成的APP 片段APP586-695 更容易被β-分泌酶切割。因此，通过AEP 去除APP C 端片段可以缓解空间障碍，并通过β-分泌酶促进APP处理，从而加速Aβ 的产生。此外，AEP 剪切生成的APP1-373 片段具有更强的神经毒性。AD 患者大脑切片中，具有AEP剪切的APP586-695片段免疫反应性的阳性神经元比例比对照组显著增加；当从5XFAD 小鼠中清除所有AEP 时，Aβ 斑块面积减少至5XFAD小鼠的约60%[45]。所有这些研究都提示抑制AEP可能减轻AD的进行性神经变性。

4 AEP激活与TBI后的AD样tau蛋白病变

tau 蛋白的磷酸化水平受到蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性平衡所调控，TBI 发生后，由于组织直接机械变形引起的继发性损伤期间tau 蛋白的磷酸化水平可能会改变[1]。Hu 等[46]的研究显示，TBI 可以导致脑组织中乳酸增加，这可能有助于AEP的激活。进而AEP 切割SET 和tau 蛋白，从而间接导致AD 脑中tau 蛋白的过度磷酸化，引起AD 发生。该研究使用了重复性轻度脑损伤（r-mTBI）小鼠模型，发现3xTg-AD 小鼠脑中tau 蛋白过度磷酸化受到AEP 活化的影响。AEP 活化也与r-mTBI 后的tau 蛋白过度磷酸化有关，可能是通过切割SET 蛋白使其从神经元细胞核转移到细胞质，并进而抑制PP2A 活性，导致tau 蛋白异常过度磷酸化。利用经典自由落体实验成功复制中重度TBI 模型，应用AEP 抑制剂下调AEP 活性，促进SET 蛋白重新回到神经元核内，可解除对PP2A 的抑制，从而减轻tau 蛋白磷酸化水平，缓解突触损伤和认知功能障碍。这些研究结果进一步证实AEP 抑制剂能有效缓解AD 样神经退行性疾病导致的认知功能障碍。

5 结论

尽管AD 研究领域取得了较大的进步，但AD 的诊断主要取决于临床表现。因此，在临床实践中常常错过或延迟诊断和有效治疗。TBI 与神经退行性疾病，特别是TBI 诱发的AD 是一个复杂的过程，需要进行广泛的研究才能更好地理解。目前TBI 相关AD 的研究主要聚焦在tau 蛋白病变、Aβ 沉积及临床表征的痴呆发病机制。

TBI致大脑局部酸化环境导致AEP激活，激活的AEP 则可介导AD 关键分子tau 蛋白、SET 蛋白、APP等的水解过程。例如，通过AEP 截断SET 蛋白会引起tau 蛋白异常过度磷酸化，而AEP 介导的APP 和tau 蛋白截断分别促进Aβ 和tau 蛋白的沉积，从而导致Aβ毒性和tau蛋白病变，加重AD 的病变及行为学异常。因此，阐明AEP 在AD 进程中对APP 和tau 蛋白的相互作用关系，以AEP产生的片段作为AD的诊断标志物，或者找到更高效的AEP 抑制剂，将为TBI所引起的AD 样神经退行性病变的早期诊断和干预提供更好的策略。