肺炎克雷伯菌生物膜形成及调控机制的研究进展

贾 雯，郭瑞林，2

1陕西中医药大学医学技术学院，陕西咸阳 712000 2陕西中医药大学第二附属医院检验科，陕西咸阳 712000

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KPN)是一种医院内常见感染菌，现也可引起严重的社区感染，因KPN高产超广谱 β-内酰胺酶和碳青霉烯酶，2017年WHO已经将KPN列为具有“危急威胁”的细菌[1- 2]。研究表明60%～80%的细菌感染，尤其是设备相关感染和慢性感染是由细菌形成生物膜引起的，生物膜形成使细菌对宿主防御机制的抵抗力增强，临床常规抗菌治疗无效[3- 4]。此外，生物膜可促进细菌间基因水平传播，主要的机制有：生物膜形成使细菌密度增加并降低了菌间的空间距离，为基因水平转移的发生提供有利条件；生物膜中细菌质粒的拷贝数及转录增加，其形成增高了细菌基因水平转移频率；同时，也有研究显示生物膜引起的严格反应可上调细菌整合子的表达，整合子介导细菌抗生素耐药基因的传播[5- 7]。对KPN的研究显示生物膜形成与耐碳青霉烯的分离株之间存在显着相关性，碳青霉烯类抗生素被称为“最后的抗生素”，而耐碳青霉烯KPN(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)除了对多种β-内酰胺类抗生素耐药外，这些菌株的耐药基因还可以通过水平转移在不同的细菌物种之间传播，生物膜的形成使传播变的更频繁[3，8]。因此，对KPN生物膜形成因素及调控机制的相关研究是临床迫切需要解决的问题，也可为临床抗生物膜感染治疗以及新药研发提供新的方向。本文就KPN生物膜形成的因素及调控机制的最新研究进展进行综述。

生物膜的形成

生物膜是细菌附着在生物或非生物表面的微生物群落，细菌从浮游状态转变为生物膜状态是一个受到环境与遗传因素高度调控的过程。生物膜形成的过程主要包括：可逆附着阶段、细菌黏附聚集阶段、增殖阶段、生物膜成熟阶段、扩散/分离阶段。浮游细菌受环境刺激对各种环境信号做出应答，附着在物体表面形成菌落；在菌落群体感应系统的作用下持续产生由多糖、蛋白质和脂质等组成的水合基质成熟为大菌落；随着时间的推移细菌可以从成熟的生物膜中分离，回到浮游状态，在新的表面形成生物膜。KPN生物膜的形成主要受菌毛、多糖、群体感应系统、外排泵等因素的影响，菌毛和多糖主要发挥黏附和组成生物膜结构的作用，其中菌毛的黏附作用主要受c-di-GMP分子调控，荚膜多糖与脂多糖是生物膜形成中多糖黏附的主要成分，其调控受到环境中碳源的影响，群体感应系统则通过细菌分泌的信号分子协调菌群密度，促进生物膜成熟，外排泵的高表达在成熟生物膜中发挥作用[9]。

KPN生物膜形成的影响因素及调控机制

菌毛在KPN生物膜形成的作用及调控机制菌毛是肠杆菌的外部结构，主要促进细菌附着介质表面、细菌聚集和生物膜的形成。KPN主要产生Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛参与生物膜的形成[10]。Ⅰ型菌毛由Fim基因簇编码，其中FimA基因编码的蛋白构成菌毛主要亚基，FimH蛋白是位于菌毛尖端的黏附素，主要黏附表面含有甘露糖成分的物质如泌尿生殖道上皮细胞，促进生物膜形成，导致难治性尿路感染发生；由mrkABCDF操纵子编码的Ⅲ型菌毛，主要由菌毛亚单位MrkA和小分子黏附素MrkD组成，在人体内外均介导生物膜的形成。MrkD促进KPN黏附不同类型的细胞如气管上皮细胞、肾小管细胞等，在人体内形成生物膜；MrkA则主要黏附于非生物材料表面，启动KPN在留置的导管和气管内管上形成生物膜[11]。研究显示KPN产生的KPF菌毛和ECP菌毛可能也参与生物膜的形成，其调控机制是否与铁吸收相关蛋白Fur蛋白相关还需进一步研究[12- 13]。而KPN菌毛除了在生物膜形成初始阶段发挥作用外，也可维持荚膜多糖结构流动性，这种流动性有利于KPN之间高效黏附以形成成熟稳定的生物膜[14- 15]。

对KPN菌毛的形成进行调控以抑制菌毛表达或破坏菌毛结构，可防止细菌发挥黏附作用，影响生物膜形成，有效控制疾病感染[16]。目前发现介导KPN发挥黏附与侵袭作用的膜蛋白的缺失会下调Ⅰ型菌毛的表达，进而减弱细菌的黏附定植能力。研究显示三磷酸腺苷结合盒转运家族的Sap(sensitivity to antimicrobial peptides，Sap)转运蛋白是KPN黏附人肝细胞和各种上皮细胞(如肠、肺和膀胱上皮细胞)的必需蛋白，SapA蛋白缺失的KPN可显著下调Ⅰ型菌毛FimA蛋白的表达，明显降低KPN肠道定植能力[17]。同时，有研究表明细胞内增殖F(intracellular multiplication F，IcmF)家族蛋白是组成Ⅳ型分泌系统T6SS的保守内膜蛋白，促进KPN在宿主体内的黏附与侵袭，而IcmF1/IcmF2蛋白缺失的突变株下调Ⅰ型菌毛转录表达，降低KPN定植能力，但具体调控机制还需进一步研究[18]。脂蛋白BamB是锚定在革兰阴性菌外膜蛋白周质面的辅助结构蛋白，其表达缺失使KPN的Fim基因转录水平显著下调，Ⅰ型菌毛产生降低32倍，但因脂蛋白BamB缺失表达影响外膜结构的完整性，对Ⅰ型菌毛的调控还需进一步研究[19]。除了Ⅰ型菌毛，大量研究表明Ⅲ型菌毛是KPN生物膜形成的主要影响因子，对它表达的调控可显著下调生物膜的形成。c-di-GMP是一种受体广泛的转录调节因子，可协调细菌多种生理过程以利于细菌适应环境变化。研究表明c-di-GMP通过调节与Ⅲ型菌毛基因簇相邻的操纵子mrkHIJ影响菌毛的合成，其中MrkI是LuxR型转录调节因子，可激活其自身的操纵子并调节Ⅲ型菌毛表达，MrkH是Ⅲ型菌毛基因簇的核心转录激活因子，与c-di-GMP结合正反馈激活Ⅲ型菌毛表达，是引发生物膜形成的主要机制，这使其成为防止生物膜形成的理想靶标，而MrkJ通过编码磷酸二酯酶降解c-di-GMP，从而影响MrkH转录激活因子的活性，抑制Ⅲ型菌毛表达[20]。组蛋白样核苷结构蛋白H-NS是Ⅲ型菌毛基因表达的正调节剂，在H-NS缺失的情况下，mrkA基因表达被抑制，KPN生物膜形成减少了10倍[21]。不同的环境刺激菌毛的调控机制也不同，如可感应渗透信号OmpR/EnvZ双组份调节系统和含Fe-S簇的转录因子IscR分别在高渗环境下和含铁的环境下通过直接或者间接影响c-di-GMP水平调控Ⅲ型菌毛的形成[22- 23]；人体内的肺表面活性剂磷脂酰胆碱和胆固醇也可诱导mrkA启动子的转录提高Ⅲ型菌毛的表达介导KPN生物膜形成[24]。第二信使环状单磷酸腺苷cAMP-cAMP受体蛋白(cyclic AMP receptor protein，CRP)也是全局调节蛋白之一，主要参与细菌的碳代谢物抑制过程，近期研究表明，其也可作用于Ⅰ型和Ⅲ型菌毛调控机制介导菌毛表达[25]，并且在Ⅲ型菌毛的mrk操纵子上游区域，发现了潜在的CRP结合位点，可正调控该操纵子的表达，促进Ⅲ型菌毛的合成[26]。菌毛起源于细菌膜内侧基粒上，目前已发现KPN膜蛋白表达的完整性对菌毛表达和结构的稳定性起至关重要的作用，但具体的作用蛋白和调控靶点还需进一步地探索。同时，高效转录调控因子c-di-GMP和cAMP-CRP均促进菌毛形成，二者之间是否有相互作用也可作为未来研究方向以促进深入了解菌毛的调控过程，为有效阻止生物膜形成打下基础。

多糖在KPN生物膜形成的作用及调控机制细菌生长产生的多糖主要起保护、黏附和组成生物膜结构的作用。多糖不仅能包裹在细菌表面形成多孔支架结构阻止或限制有害分子的渗透，还可以与抗菌肽相互作用，阻止其杀伤细菌；聚集的多糖促进细菌间和细菌与介质间黏附，有利于细菌定殖；而且多糖还可以与蛋白质等大分子形成网络为生物膜提供稳定结构，使细菌群落分层并建立浓度梯度[27]。参与KPN生物膜形成与成熟的多糖主要为荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。

CPS在KPN生物膜形成的作用及调控机制：部分临床分离的KPN会产生一种黏液样的基质包裹在细菌细胞壁外层被称为荚膜。除含有大量的水分外，其组成大多为多糖类物质，是K抗原的主要成分。CPS主要通过稳定KPN在基质上的黏附性于生物膜的初始形成过程中发挥作用，并且通过调整细菌的空间分布规则进一步调节细菌聚集，促进KPN形成具有典型三维结构的成熟生物膜[27- 28]。同时，CPS还可通过降低炎性因子抑制或损伤宿主细胞的吞噬作用，有效保护生物膜内菌体免受或少受如溶菌酶、补体、抗菌肽等多种杀菌/抑菌物质的损伤，使细菌高效的适应环境变化[29]。多糖分子组成和构型的多样性，使荚膜结构极为复杂，目前至少已经发现有79种类型的荚膜[30]，其中K1、K2、K20、K57荚膜血清型常与高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HvKP)相关[31]。HvKP主要常见于亚洲地区，因能产生大量CPS，致病性较强，可在健康人群中形成如化脓性肝脓肿、眼内炎等严重感染，是社区医院的严重危害菌[2]。研究显示HvKP与生物膜形成显著相关，且K1型HvKP中参与CPS链接形成的聚合酶magA基因的高表达导致HvKP在气液界面处形成生物膜[32]。同时,高毒力CRKP的产生无疑可能会成为下一个“超级细菌”，生物膜的形成将加重其危害程度，应引起临床高度重视[33- 34]。

对KPN CPS进行分析显示[30]，cps基因簇负责编码KPN CPS，在cps基因簇的5’端有6个高度保守的基因组(galF、cpsACP、wzi、wza、wzb、wzc)，主要编码CPS合成转运和加工的蛋白质；在3’端发现编码葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶和UDP-葡萄糖脱氢酶的保守基因，是合成CPS的基础；而中间区域(可变区域)主要包含编码 CPS 亚基聚合和组装的基因，如编码糖基转移酶、转位酶、聚合酶和修饰酶(乙酰基转移酶、丙酮酰基转移酶等)的基因，因其表达差异性，导致CPS结构多样，丰富了K抗原类型[35]。研究显示荚膜的K抗原血清型的特异性与wzi/wzy基因座的序列高度相关，对这些基因座进行测序可对KPN的K抗原血清型进行分型[30，36]，为临床早期发现严重致病菌提供依据，及时进行早期治疗。

KPN CPS的调控机制较为复杂，目前发现的调控因子主要有：CsrB碳源利用系统、RcsAB双组份系统、rmpA/rmpA2蛋白、KvrB、KvrA、KvgA、KvhA、KvhR和Fur蛋白。其中较为主要的是CsrB碳源利用系统和RcsAB双组份系统，这些系统本身都受多个基因的调控：CsrB是碳储存调控小RNA，它整合了来自UvrY-Bara二组分系统和各种碳代谢基因的信号，被DksA激活后，促进cps基因转录，提高CPS的产生，可被CsrD靶向降解[37]；RcsAB是一种非典型的两组分调节系统，在galF基因启动子区域存在RcsAB转录调控的特定DNA序列，正向调节CPS的产生，rcsAB基因敲除菌株的CPS产生水平和生物膜形成能力均降低。同时，RcsB对CPS合成的调控也取决于rmpA蛋白的辅助作用[38]。rmpA/rmpA2蛋白通过与cps基因启动子区域的靶位结合正向调控cps基因的转录使KPN高表达CPS，且rmpA/rmpA2蛋白与HvKP菌株高度相关[39]。在KPN中发现KvrA和KvrB(与大肠杆菌的SlyA和MprA同源)属于MarR调节蛋白家族，MarR调节蛋白家族主要影响细菌抗生素抗性和荚膜调节因子的表达。对大肠杆菌研究显示，SlyA是H-NS的拮抗剂，H-NS可抑制KPN中RcsA表达，SlyA解除H-NS介导的转录沉默促进荚膜合成；MprA是一种转录调节因子，影响荚膜的合成[40]。而KPN中KvrA基因和KvrB基因缺失的突变菌株表现出CPS产量的减少，但其是否通过驱动cps基因的启动子调节荚膜表达还有待研究[41]。环境因素也影响荚膜的表达，研究显示感应环境中的自由基压力和缺铁环境的KvgA/KvgS双组份调节系统，在压力环境下，反应调节因子KvgA通过作用于orf基因激活cps基因的表达，且KvgA 是 KvhA和KvhR表达的自动调节子和激活子，即：这3个同源应答调节剂相互协调控制荚膜的表达[42]。当KPN生活在富含铁的环境中时，荚膜多糖的表达被降低，这主要是因为Fur蛋白抑制了基因rmpA和RcsA的转录[43]。碳水化合物磷酸转移酶系统可转运和磷酸化环境中存在的各种糖以供细菌生长。在KPN中发现碳水化合物磷酸转移酶系统通过调节CPS大量形成导致生物膜形成增加[44]。CPS的高表达不仅在KPN的免疫杀伤及生物膜形成和成熟过程中发挥作用，也是HvKP的重要毒力因子可引起严重感染。CPS的调控除受到环境中碳源的影响外，调控转录因子之间的相互作用也是未来需要进一步研究的方向。

LPS在KPN生物膜形成的作用及调控机制：LPS是革兰阴性菌细胞膜的主要成分，由脂质A、核心多糖和O抗原组成。KPN生物膜形成过程中LPS参与KPN与非生物表面的初始黏附，研究表明O抗原除作为一个重要的毒力因子可保护细菌免受宿主损伤，利于细菌定植感染，且当KPN处在模仿体内血液循环系统的环境时，CPS和O抗原是生物膜初始聚集体形成的基本物质[45]。KPN中LPS和CPS并非完全独立地产生，在LPS生物合成中起重要作用的酶也影响KPN CPS的数量和结构[46]。KPN LPS生物合成和输出涉及4个不同的基因簇：lpx、waa、rfb、lpt，其中编码脂多糖O抗原合成的核心基因簇为rfb基因组，主要由wzm、wzt、wbbM、glf、wbbN、wbbO等6个编码基因组成[47]，其合成由3种类型的酶完成：核苷酸激活糖的生物合成、多糖重复单元的合成以及重复单元的组装和跨膜运输(脂肪酶)，主要依赖于三磷酸腺苷结合盒转运蛋白途径调控[48- 49]。将LPS的合成机制作为靶点进行攻击，不仅影响荚膜与生物膜的形成，也可延缓疾病的恶化发展[47，49]。

脂质A作为模式识别受体TLR4的有效配体可被宿主免疫系统识别清除，但KPN通过修饰脂质A的结构可逃避免疫系统的杀伤。KPN脂质A的生物合成主要由lpx基因编码产物参与、PhoPQ两组分系统进行调节。脂质A在PhoPQ调节的加氧酶lpxO和lpxL基因编码的脂质A修饰酶的作用下，可介导KPN对吞噬作用的抵抗性、逃避宿主的先天免疫、保护KPN免受多黏菌素的侵害[50- 51]。有研究显示MgrB是一种小的(47个氨基酸)膜结合肽，是PhoPQ两组分调节系统的负反馈调节剂，mgrB基因突变使PhoPQ调控脂质A重塑，赋予KPN对多黏菌素和哺乳动物抗菌肽的抗性[52]。另外，lpxL2酶为lpxL基因编码产物的主要成分，lpxO介导的lpxL2转移肉豆蔻酸酯的羟化作用，主要参与脂质A酰化作用，由于lpxL2和lpxO基因的突变，使KPN易受抗菌肽的影响[51]。多黏菌素是治疗CRKP感染的有效药物之一，脂质A修饰功能导致KPN对多黏菌素产生耐药性，因此，对脂质A修饰机制的研究可作为KPN药物开发的候选靶标。

群体感应系统在KPN生物膜形成的作用及调控机制因生物膜形成的动态性和环境刺激的变异性，细菌必须具有快速、广泛协调微生物群体中基因表达信号的能力，这一过程主要受群体感应(quorum sensing，QS)系统调控，QS系统是细菌群体密度信号的感受系统，细菌自身通过分泌自诱导信号分子相互沟通，响应种群密度的变化调节生物学功能，以适应环境变化，QS系统在生物膜形成全程发挥作用[53]。KPN的QS系统主要包括 Ⅰ 型和 Ⅱ 型，分别分泌AI- 1和 AI- 2自诱导信号分子。Ⅰ型QS系统是细菌种内交流的高度特异性系统，其AI- 1信号分子由LuxI基因编码的酶催化合成，LuxR蛋白转录调控AI- 1信号分子组成，而Ⅱ型QS系统与Ⅰ型QS系统不同，Ⅱ型QS系统还具有种间交流的功能，即它不仅能使细菌响应自身产生的AI- 2，还可以响应其他物种产生的AI- 2[54- 55]。AI- 2信号分子在KPN生物膜形成中起主要作用，不仅促进KPN生物膜的形成与成熟，对生物膜结构稳定性也造成一定的影响，其产生依赖于luxS基因。研究显示KPN协调单个细菌间分泌的AI- 2浓度达到阈值时，可触发信号传导的级联反应，诱导CPS、LPS、菌毛等多种基因(如wzm、wbbM、mrkA等)的表达，启动生物膜的形成，诱导生物膜成熟；此外，另一研究表明KPN的luxS基因缺失突变株，与野生菌相比，突变株产生的生物膜结构疏松，大菌落的形成减少[55- 56]。同时，QS信号分子也可直接或间接地作用于第二信使如c-di-GMP 和cAMP，将复杂的环境信息信号转换为一般细胞内信号，促进生物膜形成。对群体淬灭剂和QS抑制剂的研究显示，通过抑制QS系统的信号分子的表达，可显著下调生物膜的形成与成熟[57- 58]。基于KPN对临床抗菌药物的高度耐药以及生物膜的形成使耐药情况加剧发展的现状，QS在生物膜形成过程中的调控功能使群体淬灭剂和QS抑制剂被认为是开发新的抗感染药物有前景的靶标。同时，细菌往往在非理想生存条件下与多个物种混合生长，QS介导的细菌行为在细菌适应环境变化中起中心作用。未来，应模拟细菌自然生态位，集中研究在细菌生物膜空间结构和/或非理想条件下细菌之间的通讯是如何运作的，以阻止有害细菌的群体感应，促进有益细菌的群体感应。

外排泵在KPN生物膜形成的作用及调控机制细菌细胞膜中介导主动和被动转运的外排泵和孔蛋白可用于沟通菌体内外的信息，利于细菌适应环境变化。有证据表明外排泵的产生与生物膜形成有关，可能的机制为：外排泵可外排形成多糖和QS系统所需分子；可间接调控参与生物膜形成的转录因子；通过影响细菌和其他表面的黏附促进聚集[59]。对外排泵抑制剂的研究显示，外排泵抑制剂与抗菌药协同作用显著降低KPN生物膜形成[60]。研究显示多重耐药KPN外排泵编码基因的上调表达使其生物膜形成能力较敏感株强[61]。同时仅在产生生物膜的泛耐药KPN中发现AcrAB外排泵的上调表达，外排泵导致的KPN耐药性与生物膜形成能力显著正相关[9]。在CRKP菌株中发现，VIM- 1与IMP- 1耐药基因与生物膜形成存在显著相关性，但具体的机制还需进一步研究[62]。而KPN生物膜的形成会上调acrA、emrB、oqxA、qacEΔ1等外排泵基因的表达，进一步增加细菌的耐药性，利于细菌在抗菌素条件下存活[63]。即，KPN外排泵的表达与生物膜的形成是相辅相成的，对于抑制细菌外排泵表达的因素也会影响生物膜的形成。但对外排泵确切在生物膜形成中的作用的研究较少，没有直接的证据表明抑制特定的外排泵会如何影响生物膜的形成。因此，研究高效的外排泵抑制剂与质谱法和代谢组学研究相结合，确定受抑制影响的同源外排泵底物，可能是发现外排泵确切作用的一个有效手段。

KPN易形成生物膜，且对临床分离的CRKP菌株研究显示其不仅形成生物膜能力较强，且形成生物膜后导致CRKP感染死亡率升高[8，64- 65]，但也有部分研究表明CRKP菌株形成生物膜的能力较弱，可能是因为CRKP菌株缺失了与生物膜形成相关重要基因的表达，如调控菌毛形成的MrkH基因；也发现CRKP菌株中高黏液型形成生物膜能力较不产黏液型形成生物膜的能力弱，可能是CPS的高表达覆盖了菌毛，导致细菌无法黏附于生物表面，从而生物膜形成减弱[64，66]。在KPN生物膜的形成过程中，细菌菌毛的表达直接影响生物膜的初始黏附与形成，同时菌毛可维持CPS流动性使多糖发挥保护细菌免受宿主与环境作用的杀伤、促进细菌黏附聚集、稳定生物膜初始形成的作用，从而形成稳固的空间结构促进生物膜成熟。细菌形成初始黏附与聚集后，群落密集系统信号分子通过协调菌毛与多糖的表达，募集空间环境中细菌以形成成熟的生物膜。而外排泵与生物膜形成是相辅相成的，在生物膜初始形成中外排泵主要负责生物膜形成物质的外排，生物膜成熟后则进一步促进外排泵的表达利于菌株生存。因此，菌毛的表达在生物膜形成中发挥较为重要的作用。

展 望

KPN在全球范围的流行，尤其CRKP菌株的产生及其耐药基因的广泛传播，对人类健康造成严重威胁。高毒力型KPN和多重耐药型KPN与生物膜形成显著的相关性更是医院内感染控制的首要目标。KPN生物膜的形成过程中菌毛和多糖发挥初始生物膜形成作用，群落感应系统则协调二者的表达以形成成熟生物膜，外排泵的高表达与生物膜形成相辅相成。目前对KPN生物膜形成及调控机制的研究发现通过抑制菌毛表达、破坏菌毛结构、攻击多糖形成及修饰靶点可显著抑制生物膜的形成，有效控制感染，如MrkH表达抑制剂、高亲和力单价和多价FimH拮抗剂以及作为抗生素研发靶标的脂质A合成酶(LpxA、LpxB、LpxC、LpxD)和CPS、LPS合成基因wzm、wzt被广泛研究，同时还有CPS和LPS疫苗的研发正在进行。但是，KPN多糖成分的异质性、糖苷键、立体异构形式以及参与生物合成和运输的蛋白质的伴随变异可能是设计对抗多种克雷伯菌属的抗生素和疫苗的一大挑战。通过抗生素基因测序技术结合宏基因组学方法对KPN临床菌株进行研究将有助于设计多价疫苗以控制感染。同时发现群体感应系统可直接或者间接地调节c-di-GMP和cAMP-CRP影响菌毛和CPS生成，有大量研究表明c-di-GMP在生物膜形成中的作用，未来可着重研究cAMP-CRP如何影响生物膜形成及与c-di-GMP之间有无相互作用。对群体淬灭剂和QS抑制剂的研究显示，它们可通过抑制LuxS基因的表达以减弱AI- 2分子的合成影响生物膜形成与成熟，未来也可将这些物质作为抗生物膜形成和预防控制细菌感染的新药进行研发，但这些物质对生物膜形成具体的作用机制以及对人体的影响仍需进一步探索，而通过将质谱法和代谢组学研究方法相结合，可能是一个有效的研发手段。