RP-HPLC法测定醋氯芬酸叔丁酯的质量分数

侯晓蓉，肖玲琳，单伟光

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

醋氯芬酸(Aceclofenac，ACF)是一种新型的非甾体苯醋酸类抗炎症类药物制剂，具有较强效的止痛、退热和抗关节炎症等临床作用[1]。据报道：与其他非甾体抗炎药物(NSAIDs)相比较，ACF治疗指数更好，对胃肠道的耐受性更高，胃溃疡发病机率更低，是一种疗效好、安全性高的药物[2-4]，主要用于治疗关节炎、骨关节炎或风湿性强直脊椎炎等炎症性疾病，在临床治疗上具有非常广阔的应用前景[5-6]。由于工艺的改变，会引入一个医药中间体醋氯芬酸叔丁酯(Aceclofenac tert-butyl ester)[7-8]。醋氯芬酸叔丁酯作为醋氯芬酸的关键中间体，在醋氯芬酸原料药或制剂中属于有关物质，对药品的质量会造成一定的影响。因此需要对醋氯芬酸生产工艺中的中间体醋氯芬酸叔丁酯进行质量分数的检测，以确保醋氯芬酸的质量。在国内外的研究中，有大量对醋氯芬酸的质量控制标准，但针对医药中间体醋氯芬酸叔丁酯目前还没有相关的检测标准发布。因此建立一种醋氯芬酸叔丁酯的质量分数检测方法尤为重要。药物质量分数的测定方法有滴定法、色谱法和燃烧法等。其中色谱法由于其专属性好、准确度和灵敏度高等优点而被广泛用于各类药物质量分数的检测[9-11]。笔者通过参照中国药典[12]和文献[13]中对醋氯芬酸制剂的相关检测方法，建立一套适用于医药中间体醋氯芬酸叔丁酯质量分数检测的液相色谱方法。

1 仪器与试剂

UV-1780紫外可见分光光度计(岛津)；UltiMate 3000液相色谱仪(赛默飞)；XS205十万分之一天平(Mettler toledo)；醋氯芬酸叔丁酯原料药3 批(浙江尖峰药业提供)；醋氯芬酸叔丁酯对照品(实验室自制，99.6%)；乙腈试剂(Tedia，色谱级)；磷酸试剂(阿拉丁，色谱级)，其余相关试剂均为分析级。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Utimate ODS-3(规格250 mm×4.6 mm，5 μm)；色谱仪的柱温箱稳定在25 ℃；紫外波长设置为235 nm；流动相：A相为磷酸盐缓冲液(0.112 mg/mL磷酸水溶液，NaOH试液调节pH为7.0)，B相为V(纯净水)∶V(乙腈)=10∶90的溶液；采用梯度模式进行洗脱，洗脱过程设置为0～25 min，0.080 mg/mL的A相→0.057 mg/mL的A相；25～30 min，0.057 mg/mL的A相→0.024 mg/mL的A相；30～60 min，0.024 mg/mL的A相；60～62 min，0.024 mg/mL的A相→0.080 mg/mL的A相；62～65 min，0.080 mg/mL的A相；流动相速度设置为0.9 mL/min；液相色谱单次进样量为10 μL；稀释溶剂为V(流动相A)∶V(流动相B)=3∶7。

2.2 溶液的配制

将10 mg醋氯芬酸叔丁酯对照品置于10 mL容量瓶中，用溶剂溶解后，定容，摇匀，配制成1.0 mg/mL的溶液。将1 mL配制好的对照品溶液移取到25 mL 容量瓶中，加入溶剂至恒定位置并摇匀，制成40 μg/mL的溶液，作为醋氯芬酸叔丁酯对照品溶液。将100 mg醋氯芬酸叔丁酯供试品置于容量瓶中，加入稀释溶剂至100 mL，摇匀，配制成1.0 mg/mL的溶液。准确取上述醋氯芬酸叔丁酯溶液1 mL 放置于25 mL容量瓶中，加入稀释溶剂至刻度并摇匀，配制成40 μg/mL的溶液，作为供试品溶液。取适量稀释溶剂，过滤，装入样品瓶，然后将其作为阴性空白对照溶液。

2.3 检测波长的确定

量取醋氯芬酸叔丁酯供试品溶液和对照品溶液，在紫外检测器中200～400 nm波长范围下对其进行吸收值扫描，扣除空白溶剂影响，结果显示：待测试液溶液在235 nm处有最大吸收值，故确定235 nm为醋氯芬酸叔丁酯的检测波长。

2.4 专属性试验

2.4.1 干扰性试验

10 μL醋氯芬酸叔丁酯的对照品溶液以及供试品溶液和空白溶剂溶液过滤后分别进入液相检测器，并记录相关试验结果图谱，通过结果对比显示，主峰的测定未被干扰。

2.4.2 强制破坏试验

取500 mg醋氯芬酸叔丁酯供试品于容量瓶中，添加稀释溶剂定容至50 mL，摇匀，作为破坏性试验的备用试液。取6 份2 mL的试液，分别置于20 mL容量瓶中，在不同条件下强制进行破坏测试。试验溶液具体分为1) 未破坏样品；2) 酸破坏：加入1 mL备好的1.0 mol/L 盐酸溶液，充分摇匀，于室温25 ℃左右放置1 h，用碱中和；3) 碱破坏：加入浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液约0.1 mL，充分摇匀，于室温25 ℃左右放置0.15 h，用酸中和；4) 氧化破坏：加入提前配制好的3% H2O2溶液约1 mL，在室温条件下约放置1 h；5) 高温破坏：置于80 ℃烘烤箱中加热10 h(加热过程中若溶剂蒸发，应及时补加适量甲醇，使样品处于溶液状态)；6) 光照：在(4 500±500) lx条件下持续光照7 h。将上述6 种溶液用溶剂稀释至恒定体积并摇匀，然后按照2.1节设定的色谱条件进行分析。结果表明：在各项破坏条件下，该方法可较好地分离主成分峰与相关杂质峰，该液相检测方法具有良好的特异性。

2.5 稳定性试验

取适量的醋氯芬酸叔丁酯供试品，溶解在溶剂中，配制成每1 mL溶液中约含0.1 mg醋氯芬酸叔丁酯的供试品溶液，在室温约25 ℃条件下，将其放置24 h左右，定时采样，然后根据2.1节设定的色谱条件进行分析。按药典中的外标法以醋氯芬酸叔丁酯峰面积计算出质量分数，结果见表1。试验结果表明：醋氯芬酸叔丁酯稳定性试验其峰面积的RSD为0.55%；该供试品溶液配制完成后，放置24 h内峰面积基本无变化，表明质量分数测定所用溶液的稳定性良好。

表1 稳定性试验结果

2.6 精密度试验

取适量的醋氯芬酸叔丁酯对照品溶液，过滤后，依次测定5 针(每针进样10 μL)，并记录相关色谱结果，计算该样品主成分色谱峰面积的RSD值，结果显示主成分峰面积的RSD为0.78%，表明该质量分数测定方法精密度良好。

2.7 线性试验

准确称取24.96 mg醋氯芬酸叔丁酯对照品，并置于容量瓶中，加稀释溶剂准确溶解至25 mL，得醋氯芬酸叔丁酯对照品备用试液。分别准确转移0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL备用试液于容量瓶中，加稀释溶剂准确定容至10 mL，混匀，即得质量浓度分别为49.9，74.8，99.8，125，149 μg/mL的对照品溶液。根据2.1节设定的相关色谱条件，将上述样品按质量浓度从低到高依次进行检测，并记录相关色谱结果。由样品质量浓度对测得的峰面积作线性回归方程为：y=1 249.85x+10.89，R2=0.990。结果表明：醋氯芬酸叔丁酯在 49.9～149 μg/mL范围内，其供试品质量浓度与对应色谱峰面积具有良好的线性关系。

2.8 准确度试验

取适量醋氯芬酸叔丁酯供试品，加稀释溶剂溶解，配制成每1 mL中约含1.0 mg醋氯芬酸叔丁酯的溶液，作为样品的备用试液。同法配制1.0 mg/mL的醋氯芬酸叔丁酯对照品溶液，作为对照品备用试液。移取对照品备用试液300，500，700 μL至对应容量瓶中，再分别移取0.5 mL供试品储备试液至容量瓶中，并加稀释溶剂定容至10 mL，可得3 个不同质量浓度的供试品溶液。上述各质量浓度的溶液分别配制3 份。根据2.1节色谱条件对9 个样品进行测定，记录色谱峰面积，计算出样品的加样回收率以及RSD值。结果显示：该试验的加样回收率平均值为100.07%，RSD为1.07%，表明该质量分数的液相测定方法准确度符合规定。

2.9 重复性试验

取6 份醋氯芬酸叔丁酯供试品，按照2.2节方法将其配制成供试品溶液；再准确称取10 mg醋氯芬酸叔丁酯对照品，按照2.2节所示方法将其配制成对照品溶液。并根据2.1节所设定的相关液相色谱条件，每个样品各进2 针，记录色谱峰面积。计算结果显示：该峰面积的RSD为0.69%，表明该检测方法的可重复性较好。

2.10 耐用性试验

通过调整流动相的流速、柱温箱的温度以及色谱柱的品牌型号等研究该方法的耐用性。液相条件轻微改动如下：流速由1.0 mL/min变化±0.2 mL/min，柱温由25 ℃变化±5 ℃，色谱柱的品牌类型由Ultimate ODS-3改为Agilent Eclipse XDB-C18和Shim-pack VP-ODS。根据2.1节设定的色谱条件分别注入供试样品，记录相关色谱结果，并与原方法测定结果进行比对，计算RSD值，条件和结果见表2。由表2可知：各种因素的轻微变动对测定结果没有明显影响，则表明该液相色谱方法的耐用性较好。

表2 耐用性试验结果汇总

2.11 样品测定

取3 批次醋氯芬酸叔丁酯供试品适量，用稀释溶剂配制成每1 mL溶液中含0.1 mg醋氯芬酸叔丁酯的供试品溶液，根据2.1节所设定的色谱条件，将过滤后的供试品注入色谱仪中进行测定。另以相同方式对醋氯芬酸叔丁酯对照品进行测定。样品的质量分数根据峰面积按药典中规定的外标法进行计算，结果见表3。由表3可知：3 批次自制醋氯芬酸中间体样品质量分数均大于99%。

表3 醋氯芬酸叔丁酯样品HPLC质量分数测定结果

3 结 论

使用紫外-可见分光光度计，在特定波长(200～400 nm)范围内对供试品进行UV波长扫描，排除溶剂峰的干扰，其在235 nm 波长处有最大吸收值，因此将醋氯芬酸叔丁酯的检测波长确定为235 nm。由于该试验样品溶于乙腈、甲醇等溶剂，通过试验筛选后，确定该试验流动相为乙腈和磷酸盐缓冲液。按照要求对该液相方法进行了一系列的方法学考察。结果显示：在49.9～149 μg/mL范围内呈良好的线性关系(R2=0.990)，准确度RSD为1.07%，精密度RSD为0.78%，表明该液相方法具有较优异的特异性、精密度、线性、准确度、可重复性和耐用性。该方法可作为医药中间体醋氯芬酸叔丁酯的质量控制方法，并可为醋氯芬酸药物制剂的质量评价提供参考。