系统生物学方法在骨质疏松症中医证候研究中的应用❋

章轶立，齐保玉，魏 戌△，戴建业，王 旭，申 浩，谢雁鸣

(1. 中国中医科学院望京医院，北京 100102； 2. 北京中医药大学中医学院，北京 100029； 3.兰州大学药学院，兰州 730020； 4. 北京市丰台区长辛店社区卫生服务中心，北京 100072； 5.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700)

骨质疏松症(osteoporosis, OP)主要表现为骨代谢异常，以全身性骨痛和易发生脆性骨折为特征性表现，与增龄关系密切，发病率呈逐年递增趋势[1]。中医药在提高OP患者骨密度、改善临床症状、促进骨质疏松性骨折愈合等方面具有一定的优势[2-3]。证候作为中医临床诊治的重要依据，是中医学研究中的核心要素与学理支点[4]。系统生物学是研究生物系统中所有组分(如基因、蛋白质、代谢产物等)构成，以及在特定条件下(如遗传、环境变化等)各组分之间相互关系的学科，以多种组学技术为代表，为阐释中医证候生物学基础与辨证论治的科学内涵提供了重要的方法学支撑[5-7]。现就近年来系统生物学方法在OP中医证候研究中的应用进行述评。

1 基因组学研究

基因组学关注微观的、相对稳定的生物基因精确结构、相互关系及表达调控，强调基因表达的差异是造成个体差异的主要原因。证候基因组学是在中医证候学理论指导下，运用基因组学的方法探讨OP中医证候的科学内涵，特别是研究同病异证或异病同证时基因的差异表达情况，揭示与证候形成相关的基因及其功能[8-9]。

肾藏精，主骨生髓，肾虚证与OP发病关系密切。郑洪新等[10]通过实验证实，OP肾虚证病理机制与转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、TGFβ诱导早期应答基因1(TGF-β inducible early gene, TIEG1)mRNA等表达异常有关，并运用补肾益髓中药发挥对下丘脑-肾-骨反馈机制的调控作用以预防OP的发生发展。尚德阳等[11]发现，OP的发生可能与骨、肾、下丘脑组织中Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1, Smurf1)和Smad泛素化调节因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2, Smurf2)的mRNA表达的异常变化有关，补肾中药可能通过调控上述因子表达发挥防治OP的作用。王爱坚等[12]研究提示，载脂蛋白E等位基因ε4频率升高与绝经后妇女肾虚证发生关系密切，肾虚证与载脂蛋白E基因多态性存在联系。

在绝经后OP易感基因与基因多态性研究方面，国内葛继荣教授团队前期研究结果表明，OP证候与遗传特征可能存在关联性，在维生素D受体基因bb型中，绝经后OP肾阴阳两虚证腰椎骨密度明显低于肾阴虚证患者[13]。另有研究证实[14-15]，绝经后OP肾阳虚证与骨钙素基因多态性、雌激素受体基因多态性存在关联，而肾阴虚证的发生与lncRNA uc431+的表达下调、富亮氨酸2糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1, LRG1)的mRNA表达升高有关[16-18]。研究还发现，LINC00334等8条lncRNAs可能通过调控Janus激酶/信号传导与转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等信号通路参与绝经后OP肾阴虚证的发生发展过程[19]。此外，李颖等[20]研究发现，绝经后OP中医证候与线粒体DNA拷贝数、DNA氧化损伤的产物8-羟基脱氧鸟苷酸含量存在相关性，其中肝肾阴虚证与线粒体DNA拷贝数相关性高，脾肾阳虚证与8-羟基脱氧鸟苷酸关系密切。李生强等已完成对原发性骨质疏松症肾阴虚证、肾阳虚证骨组织基因表达谱的测定，不同肾虚证候相关基因均与免疫调节相关，肾阴虚证基因还与激素合成、组氨酸代谢、矿物质吸收等通路相关，而肾阳虚证基因还与TGF-β、细胞周期等信号通路相关[21-22]。

基于现有文献，目前针对OP证候的基因组学研究主要停留在个别基因对OP证候的关联，并未从整体的角度探究OP证候发生发展的本质问题，未来研究仍需构建OP非肾虚证候相关的基因差异表达谱，筛选出与之有关的基因，并从功能基因组学的角度对其调控网络进行分析。同时，从“同病异证”和“同证异病”的角度比较基因表达谱的差异，寻找OP证候的同一性和差异性，进而揭示OP证候的科学内涵，并为其客观化诊断提供依据。

2 蛋白质组学研究

蛋白质组学是对基因组学的继承与发展，可系统分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间存在的相互关系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律[23-24]。证候蛋白质组学研究有助于获得疾病证候的生物学实质与生物标志物，进一步使证候研究走向客观化与标准化[25]。

国内学者已初步发现绝经后OP肾阳虚证与LTBP1蛋白表达下调相关联，而肾阴虚证与CLCFI蛋白下调存在关联[26-28]。王蕾等[29]研究发现，破骨细胞相关因子蛋白表达水平与肾阳虚证、脾胃虚弱证、肝肾阴虚证、气滞血瘀证具有相关性。其中，巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子可作为区别肾阳虚证与其他证候的生物标志物。

邓洋洋等[30]发现，肾虚OP模型大鼠Smurf1蛋白在股骨、肾中表达降低，在下丘脑中表达水平升高，而补肾中药可能通过调控股骨、肾、下丘脑中Smurf1表达发挥防治原发性OP的作用。章建华等[31-32]运用左归丸与右归丸含药血清，对去卵巢大鼠肾阴虚证与肾阳虚证动物模型进行干预，结果证实两方均能促进成骨细胞增殖与碱性磷酸酶表达水平，并对细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)与β-catenin的蛋白表达具有一定调控作用。此外，对比不同动物模型中蛋白表达水平发现，“左归丸滋肾阴”作用更强，而“右归丸温肾阳”作用更强，与中医理论相符。伍超等[33]结合网络药理学与实验验证，发现肾精亏虚证可能与促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)信号通路中低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2, GRB 2)、MAPK3等蛋白密切相关，而补肾益精中药通过调控EPO信号通路中靶点蛋白水平的降低，可能是治疗肾精亏虚证的作用机制之一。另1项研究表明，电针命门穴可促进骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)及其信号传导蛋白Smad1/5表达水平，为电针治疗绝经后OP提供了基础研究证据[34]。

与证候基因组学的研究现状相似，OP证候层面的蛋白质组学研究仍然集中于对疗效机制的科学阐释，多数聚焦于补肾类中药可能作用的靶点。而从证候衍变规律角度出发，探索证候动态变化及其生物学内涵的相关研究还不够深入，尚未形成完整的OP证候蛋白质组学证据链。

3 代谢组学研究

代谢组学是对生物体内的代谢物进行定量分析，试图寻找代谢物与生理病理变化相对关系的研究，也是系统生物学的重要技术方法之一[35-36]。OP属于全身代谢性疾病，代谢组学为OP临床诊断和治疗提供了一种整体的方法，对深入理解OP病理机制及中药等干预机制具有重要作用[37]。证候代谢组学通过测定不同证候间代谢产物的差异，为证候生物学基础研究开辟了新途径。

徐琬梨等[38]应用核磁共振氢谱技术测定绝经后OP常见实证(肾虚对照组、肾虚血瘀组、肾虚痰湿组、肾虚气滞组)血清代谢产物，结果表明各组间存在差异代谢物，主要生物学功能涉及体内能量代谢、氨基酸代谢、蛋白代谢等方面，证实不同中医证候与代谢产物密切相关。张波等[39]通过OP肾虚血瘀证与骨质疏松症常规检测指标相关性研究证实，OP肾虚血瘀证可能与血清Ⅰ型胶原C末端肽、骨密度、25羟维生素D、雌二醇等具有相关性。帅波等[40]研究证实，骨转换标志物β-骨原交联、血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子含量与中医“本痿标痹”证候评分存在正相关，建议骨代谢与炎症指标可作为OP进展评价及疗效判定的依据。

当前多数研究虽然通过对骨代谢指标相关产物检测，发现与OP证候相关的部分代谢指标，但针对骨代谢终端产物的代谢组学研究依然较少。此外，在中医药干预OP的作用机制研究中，虽然应用了代谢组学方法，但因与证候关联性较弱，因此未引用相关原始研究文献。

除应用基因组学、蛋白质组学、代谢组学方法研究OP证候外，还有学者运用表观遗传学方法研究中医证候，主要表观遗传机理是miRNA、DNA甲基化，但相关研究仍处于探索阶段[41]。

4 讨论

随着生命科学大数据时代的到来，组学技术广泛运用于中医中药研究，各种组学方法已在证候生物学基础研究方面取得了积极进展[43]。系统生物学因其强调整体性、时效性的特点与中医学整体观念、辨证论治的思想较为吻合[44]，借助系统生物学的方法与思路，不仅丰富了OP证候的理论内涵，拓宽了研究思路，也有助于搭建微观研究(基因、蛋白、代谢组学研究)与整体研究(证候研究)的桥梁，为OP证候客观化提供科学依据[45]。

尽管目前运用系统生物学进行OP证候本质研究尚处于探索、发展阶段，但基于系统生物学特点、研究思路、技术方法为OP证候本质的研究带来了新的方向[46-47]。因此，将系统生物学运用于OP证候研究，建立多方向、多层次的组学技术平台，并通过计算生物学等数学语言定量描述生物体功能、表型及行为，对揭示OP证候本质具有重要意义，进而促进中医药现代化研究进程。