基孔肯雅病毒小鼠感染模型研究进展

蒋小武，朱乐欣，艾莎珍

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)属于披膜病毒科病毒，是一种主要经伊蚊叮咬而传播的虫媒病毒[1]。该病毒颗粒直径约65 nm，具有20面体衣壳，基因组大小约11.8 kb，含两个主要的开放阅读框，其中靠近5′端的ORF编码4种非结构蛋白(nsP1- nsP4)，靠近3′端的编码3种结构蛋白(衣壳蛋白C，两个包膜糖蛋白E1和E2)和2种小肽(E3和6K)[2-3]。CHIKV流行毒株分为亚洲(Asia)型、西非(WA)型、东中南非(ECSA)型和印度洋(IOL)型4个遗传谱系[1,4]。CHIKV有城市(urban)和森林(sylvatic)两种不同的循环模式进行传播扩散，其中城市感染模式由人类被蚊媒叮咬再传染人类，而森林模式则从非人灵长类动物起始传给蚊媒再传给人类。Sylvatic模式传播的CHIKV主要局限于于非洲森林的伊蚊和非人灵长类动物体内，流行性和感染规模有限。大部分CHIKV感染暴发病例均为城市传播模式，埃及伊蚊和白纹伊蚊作为重要的传播媒介，极易在人群密集的地方引发基孔肯雅热疫情[5-6]。不同流行毒株基因组变异，尤其是囊膜蛋白或非结构蛋白某些位点的突变，会提高CHIKV对伊蚊的适应性，增强病毒复制与传播能力[2]。

人类感染基孔肯雅病毒可以发生基孔肯雅热(Chikungunya fever，CHIKF)。CHIKF的典型症状是急性发热与严重关节痛，具体表现为多关节痛、关节炎、腱鞘炎、肌痛、头痛和皮疹，关节疼痛位置一般对称性的分布于手臂和腿部。该病致死率较低，急性感染患者7～10 d内症状自行消退，但30%以上的患者会发展为慢性感染，出现持续性的关节肿胀和肌肉疼痛，疼痛和炎症反应可持续数月至10年之久，严重降低患者生活质量[7-9]。自1952年首次在坦桑尼亚南部地区发现基孔肯雅病毒以来，CHIKF多次在非洲、美洲、拉丁美洲、欧洲、南亚以及东南亚国家暴发，特别是对蚊媒密度较高的热带与亚热带地区威胁较大[4-5, 10]。我国于1987年首次在云南西双版纳地区发现CHIKF输入病人，2010年广东东莞暴发过一次小范围CHIKV本土感染(10例确诊)，国内多个入境口岸先后检出CHIKV输入性病例[11-13]。目前，全球已有100多个国家报道出现CHIKF散发或暴发，CHIKV被世界卫生组织认定为可能导致全球严重疫情暴发的8种潜在危险病原体及3种次危病原体之一[5,14]。

活体动物感染试验对探究CHIKV如何在体内复制、侵染与诱发机体病毒血症，解析宿主抗病毒免疫反应以及开发、评价疫苗或抗病毒药物的疗效等研究至关重要。迄今，已报道的关于CHIKV动物感染模型包括小鼠、非人灵长类动物、仓鼠以及斑马鱼[10,15-17]。非人灵长类动物模型(主要为猕猴)与人类的遗传进化关系较近，采用该模型感染CHIKV获取的试验数据更加贴近真实情况，但猕猴属于大型动物，实验材料不易获取，价格昂贵，需要专门严格的饲养环境与管理措施，加之不能完全替代人体的微环境特征，因此应用范围窄，文献报道不多。仓鼠与斑马鱼模型个体较小，尤其是斑马鱼作为模式生物，具有通体透明，发育周期短，遗传背景清晰与实验操作技术成熟等优点，但是这两种实验动物在CHIKV感染试验研究中的成果不多，结论尚不成熟，还有待进一步论证。目前，小鼠是CHIKV感染研究应用最多的动物模型，其主要优势在于实验小鼠遗传背景清晰，个体大小适宜，品系多样，成本较低，易于管理，而且和市面上众多的小鼠相关靶向基因或抗体检测试剂匹配，特定基因修饰的转基因小鼠也相对容易获得。本文旨在详细论述、汇总分析不同小鼠模型在CHIKV感染研究中的应用及其优缺点，以期增强对CHIKV感染机制的理解，并为其它蚊媒病毒动物模型的开发提供参考。

1 新生幼鼠模型

回顾性队列分析发现：怀孕母体感染CHIKV引发病毒血症，其分娩的新生儿CHIKV感染率高达50%，患儿易出现血流异常、心室功能不全、神经系统发育缺陷以及脑膜炎等神经症状，死亡风险较高[18-19]。因此，有学者采用新生幼鼠模拟人类感染CHIKV引发致死性脑炎相关表型与机制的研究。Couderc等以106PFU的CHIKV胸腹部皮下接种6 d龄与9 d龄C57BL/6新生幼鼠，结果发现幼鼠对CHIKV易感，感染后3 d即可在幼鼠皮肤、肌肉、血液、肝脏、关节组织及脑内检出活病毒。6 d龄幼鼠感染CHIKV引发的病毒性脑炎症状最为严重，所有试验组幼鼠在12 d内死亡，死亡率达100%[20]。Ziegler等以新生ICR与CD-1幼鼠进行CHIKV感染试验，结果显示感染CHIKV的幼鼠出现嗜睡、行走困难、体重增长减缓。新生幼鼠1周内出现病毒血症，腿部肌肉与脑内也可检出高滴度的CHIKV，其它症状包括骨骼肌局灶性坏死与炎症反应，但ICR与CD-1幼鼠感染CHIKV病死率明显低于C57BL/6幼鼠模型[21]。进一步采用新生幼鼠进行CHIKV脑内接种感染试验，发现该病毒可感染诱导脑内神经元与星形胶质细胞发生内源性凋亡，诱导CD206+等树突状先天免疫细胞募集、活化，引发炎症反应从而导致幼鼠形成脑炎损伤[22]。Zhang等构建了荧光蛋白标记的重组CHIKV病毒，并成功以BALB/c新生幼鼠模型进行了颅内接种试验，结果显示重组病毒能在脑内复制并有效侵染幼鼠全身脏器[23]。另外，新生幼鼠作为体内动物试验模型在抗CHIKV中和抗体与治疗药物有效性检测方面也有应用。Saraswat等以抗CHIKV高免血清被动免疫新生BALB/c幼鼠，发现幼鼠可以完全抵抗CHIKV的感染[24]。Lam等以新生幼鼠模型验证了中和CHIKV-E2糖蛋白N218表位的单克隆抗体和拮抗病毒翻译起始作用的磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物的抗病毒作用[25-26]。上述试验说明新生幼鼠对CHIKV易感，是CHIKV相对理想的感染、病理与抗病毒药物功效评估模型，但因其免疫系统发育不成熟，感染CHIKV易引发致死性脑膜炎并迅速死亡等特征，极大地限制了其在CHIKV诱发更大范围的轻、中症与急、慢性肌肉关节炎等疾病表型的致病机理、宿主抗炎与激活机体免疫反应机制等方面的应用。

2 成年野生实验小鼠模型

人感染CHIKV的主要症状表现为急、慢性肌肉肿胀、疼痛与关节炎，患者中出现持久性的病毒检出与炎症因子释放的比例越来越高，但关于CHIKV如何引发肌肉疼痛与关节炎症的机理仍不清楚[27]。有学者模仿蚊虫叮咬模式，采用足垫皮下方式将CHIKV接种至野生型成年C57BL/6小鼠体内，发现CHIKV感染小鼠足部致脚踝肿胀，并伴有关节炎、腱鞘炎、肌痛和骨膜炎等典型临床症状。CHIKV在小鼠足部关节内大量复制，并引发持续性病毒血症[28-30]。这与人感染CHIKV的常见疾病表型基本吻合，暗示成年野生型实验小鼠可能适合作为动物模型用于模拟、探索人感染CHIKV典型表型与潜在机制。比较分析不同野生型实验小鼠(C57BL/6、ICR、CD-1、WT 129和DBA / 1J)对CHIKV感染的敏感性，发现CHIKV侵染、繁殖能力以及诱导肌肉骨骼损伤的严重程度与不同品系小鼠的遗传学差异有一定关联，以C57BL/6小鼠最易感[31-33]。转录组芯片分析发现CHIKV感染C57BL/6小鼠引发关节炎的关节组织差异基因表达谱或相关免疫分子活化特征与胶原蛋白刺激小鼠引发的类风湿性关节炎以及人的类风湿性关节炎滑膜组织相应分子变化水平基本一致[34]。CHIKV诱导小鼠关节组织NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等炎症细胞活化、浸润[30,35]。Goupil等以CHIKV感染8周龄野生C57BL/6小鼠，发现CHIKV可刺激小鼠骨骼与关节相关组织破骨细胞活化，这对揭示CHIKV患者感染早期出现骨小梁和皮质骨丢失的机制具有重要意义[6,28,36]。

临床观察发现，65岁以上的老年人对CHIKV高度易感，感染后疾病表症更为严重，所有CHIKV相关死亡病例中老龄患者占比90%以上[37]。Uhrlaub等将CHIKV分别接种至12周龄与18月龄成年野生C57BL/6小鼠足垫皮下，发现18月龄组老年鼠关节肿胀症状表现更严重、持久，组织中病毒载量更高，病毒血症持续时间更长。CHIKV感染诱发过度炎症因子释放，可能直接导致老龄组小鼠适应性免疫系统功能损伤，机体分泌中和抗体与清除病毒能力显著降低[38]。有研究发现CHIKV感染C57BL/6小鼠，其血液、肝脏及脾脏等均可作为靶器官被CHIKV侵染，这些脏器中的病毒粒子4周内即可被机体清除，但小鼠关节相关组织病毒RNA或感染性活病毒可至少持续检出16周[39-40]。这些长期低水平存在的CHIKV可诱导炎性细胞浸润、炎症相关因子持续表达，从而引发慢性滑膜炎和关节炎。另外，CHIKV的长期感染可能诱导病毒适应性变异，基因组关键位点的多重突变对削弱病毒抗体中和活性、增强病毒体内存活力具有重要作用[40-41]。野生型成年实验小鼠先天免疫与适应性免疫系统发育完善，因此在抗病毒药物与疫苗开发研究方面应用更为广泛。Kuo等以C57BL/6实验小鼠模型证实广谱抗锥虫药物苏拉明可明显降低CHIKV感染后的病毒载量，下调软骨细胞数量，显著改善小鼠急性骨关节炎症状[42]。C57BL/6小鼠在CHIKV减毒苗(通过衣壳蛋白核定位序列与非结构蛋白特定功能氨基酸突变、衣壳蛋白缺失、同义密码子替换等技术使病毒致弱)与CHIKV病毒样颗粒疫苗，BALB/c小鼠在CHIKV灭活苗、重组黑猩猩腺病毒载体疫苗(ChAdOx1与ChAdOx2)、E2蛋白重组亚单位疫苗以及DNA疫苗(pCHIKV-7)等疫苗研发过程中用于评估不同候选疫苗的免疫原性与保护效力[43]。

3 转基因小鼠模型

I型干扰素及干扰素刺激信号传导途径在机体抵抗CHIKF相关严重并发症中扮演重要作用，敲除小鼠I型干扰素关键受体(IFNAR)、其他关键成分(如IRF3/IRF7)或干扰素诱导基因(如ISG-15)可显著提高小鼠易感性[1,44]。Couderc等以野生C57BL/6(WT)、IFN-α/β R+/-与IFN-α/β R-/-基因敲除小鼠分别感染CHIKV，发现WT小鼠可以完全抵抗病毒侵染，而IFN-α/β R+/-与IFN-α/β R-/-小鼠分别诱导轻度与重症感染。IFN-α/β R-/-试验组小鼠出现嗜睡、肌无力、病毒血症及神经症状，小鼠3 d内全部死亡，小鼠肝脏、脾脏、肌肉、关节、皮肤以及中枢神经系统可检出高滴度的CHIKV。组织病理观察发现CHIKV主要靶向肌肉、皮肤和关节中的成纤维细胞，对脑脉络丛与软脑膜细胞等组织嗜性也较高，组织中病毒载量高低与疾病严重程度密切相关[20]。Cook等进一步解析了不同I型干扰素亚群拮抗CHIKV感染过程的差异与机制，其中IFN-α主要作用在于阻碍CHIKV的复制和传播，而IFN-β则通过拮抗中性粒细胞介导的炎症反应缓解CHIKV的致病效应[45]。A129(I型干扰素受体缺陷)、AG129(I型与II型干扰素受体缺陷)以及STAT(干扰素信号转导激活因子缺陷)转基因小鼠模型均对CHIKV易感，试验结果与Couderc等报道的类似[46]。Tun等应用A129小鼠模型比较分析了不同谱系CHIKV毒株的致病差异，结果显示ECSA谱系毒株毒力更强，小鼠脑内与不同脏器中病毒复制水平最高[47-48]。I型干扰素调控子IRF3与IRF7双基因敲除小鼠(IRF3/7-/-)感染CHIKV，会出现出血、血管炎症和血小板减少等典型失血性休克症状，该模型对CHIKV导致出血热相关休克综合征机理研究具有重要意义[49]。Werneke等发现干扰素早期诱导因子ISG15对新生幼鼠抵抗CHIKV致死性感染发挥重要作用，ISG15基因敲除小鼠对CHIKV易感性显著增强，炎症因子剧烈释放，而且ISG15的抗感染作用不依赖于泛素样结构域UbE1L[15,37]。Delang等采用AG129转基因小鼠模型发现抗流感药物法匹拉韦(T-705)可以抑制CHIKV复制酶活性，降低小鼠体内病毒载量，减轻小鼠致死性病毒性脑炎症状，提高小鼠存活率[50]。另外，I型干扰素免疫缺陷小鼠模型在研究抗CHIKV单克隆抗体中和效应，评估昆虫特异性甲病毒嵌合CHIKV结构蛋白疫苗(EILV/CHIKV)、VSV病毒载体重组CHIKV囊膜糖蛋白疫苗(VSVΔG-CHIKV)和高效单克隆抗体编码序列对应mRNA疫苗(CHKV-24)的免疫原性与保护效力等方面均有应用[43,51]。

为分析宿主先天免疫与适应性免疫应答在CHIKV感染中的作用，有学者陆续构建了包括RNA病毒识别受体TLR3、T和B淋巴细胞重组酶激活基因1(RAG1与RAG2)以及B淋巴与T淋巴细胞本身在内的多种基因修饰小鼠模型用于探究机体抗CHIKV感染的机制。Her等发现TLR3介导调控CHIKV中和抗体分泌，Tlr3-/-小鼠对CHIKV更为敏感，缺陷小鼠体内病毒载量更高，炎性细胞浸润更加严重[52]。CHIKV分别感染野生型、CD4-/-、CD8-/-和B淋巴细胞(μMT)转基因小鼠，发现μMT小鼠易感性最强，CHIKV感染引发的病毒血症持续存在，CD4-/-和μMT小鼠临床表征最为严重，暗示CD4+，而非CD8+T淋巴细胞主导抗CHIKV保护性抗体作用的持续时间，并影响关节肿胀与关节炎等疾病的发生发展过程[29,53]。T淋巴或B淋巴细胞转基因小鼠(靶向RAG1或RAG2基因)对CHIKV易感，较野生型小鼠感染CHIKV的疾病表型与病毒血症更为严重，机体适应性免疫可通过调节炎症反应以抵抗CHIKV的感染[29,39,54]。CHIKV刺激APCs细胞分泌IFNγ，活化TH1型CD4+T细胞极化，募集炎性单核细胞至感染区域。Carissimo等发现ISG蛋白家族的Viperin因子抗CHIKV感染与其调控CD4+T细胞的极化作用有关，Viperin-/-缺失小鼠感染CHIKV诱发关节炎病理表现更为严重[55]。CHIKV感染会刺激机体γδT亚群淋巴细胞的高水平增殖，γδT细胞缺失的转基因小鼠感染CHIKV后体重增长减缓，关节肿胀与炎症反应特征明显增强[56]。上述试验说明特定免疫应答相关靶基因缺陷转基因小鼠对CHIKV易感性的改变，对深入挖掘、验证重要的宿主抗病毒效应因子、评估药物或疫苗的免疫保护效力等方面具有重要意义，但相应小鼠感染CHIKV出现的发病急、死亡快、病理周期短等现象，限制了转基因小鼠模型在CHIKV引发持续关节炎型感染表型机制研究的应用。

4 小 结

目前，基孔肯雅病毒已扩散至全球五大洲，累计引起数百万人感染。CHIKF的蔓延与传播加快了科学家们对CHIKV的研究步伐，尤其是在CHIKV诱发急性和慢性关节炎相关疾病的感染机制、疫苗与靶标药物开发等方面取得了较大进展[43,57]。合适的动物感染模型对于开展CHIKV基础与应用研究必不可少。

小鼠感染模型是CHIKV研究最深、应用范围最广的动物模型，近年来，基孔肯雅病毒小鼠模型对加快CHIKV的基础与应用性研究起到了关键性作用。不同类别或品系的小鼠感染CHIKV临床表型各有特征，适用范围略有差异，C57BL/6实验小鼠对CHIKV较为易感，遗传特性相对稳定，在病毒感染与免疫保护等应用最为广泛。新生幼鼠与转基因小鼠适用于研究CHIKV感染引发人脑炎等致死性病变的致病机制，探究CHIKV感染相关宿主关键互作因子、介导宿主抗病毒免疫相关组分的鉴定与验证、评估特定中和抗体或药物的抗病毒效果以及重组载体活疫苗与mRNA疫苗免疫保护作用，而野生型成年实验小鼠主要用于模拟CHIKV引发急性肌肉损伤与骨关节疾病、慢性持续性关节炎相关疾病以及评估不同类型的疫苗或药物保护效果。

尽管小鼠模型在CHIKV应用最多，优势明显，但其仍然存在缺陷。不同品种与年龄组的小鼠CHIKV感染结局差异较大，小鼠模型不能准确模拟CHIKV母婴垂直传播方式。另外，小鼠与人类的遗传进化关系较远，与人体肌理结构及微环境存在较大差异，病毒黏附鼠源细胞与胞内复制能力明显低于人源细胞[15,58]。小鼠寿命有限，CHIKV感染的小鼠组织易被损伤破坏[10]，也不能完整模拟人感染CHIKV引发慢性持续性疾病的终生过程。迄今为止，国内外尚无理想的动物模型能够完全模拟人感染CHIKV表现出的所有急、慢性临床表型，继续探索不同动物模型间的感染差异机制，开发、优化新的动物感染模型，仍是CHIKV研究取得突破进展的重点和难点之一。