浙江省人源猪链球菌鉴定及毒力基因检测分析

朱水荣，张 政，姚苹苹，杨 勇，方 磊，张严峻

猪链球菌(Streptococcussuis，Ss)是一种人兽共患病原菌。该菌是1987年由Kilpper-Balz发现的一个新种[1-2]，早期按照荚膜抗原的差异分为35个血清型(1～34型，1/2型)[3]，2005年，Hill等[4]从基因水平证实其中的32及34型为鼠口腔链球菌(StreptococcusofisraRi), 猪链球菌被分为33个血清型(1～31型，1/2型和33型)。近年来，基于16S rRNA以及其它保守性较高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、33又被排除猪链球菌家族[5]，这次猪链球菌被分为29个血清型(1～19型，21型，23～25型，27～31型和1/2型)。目前已知，能感染人的致病血清型主要包括1/2、1、2、7、9和14型6种类型[6-11]，其中以2型猪链球菌 (Streptococcussuistype 2，SS2)致病力最强。2型猪链球菌具有很强的侵袭能力，并产生致病性很强的外毒素，引起感染者发生严重的不可逆的休克及DIC，最后发生多器官功能衰竭而死亡[12]。1968年，丹麦首次报道猪链球菌感染导致人脑膜炎的病例[13]。其后，在亚洲、美洲、欧洲、大洋洲等地区均有人感染猪链球菌病例报道，累计感染人数已超过1 600人[14]。猪链球菌的致病机理虽然现在还不是很清楚,但研究表明和其毒力因子有密切的相关性[15-18]。以往学者们主要针对Cps、mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh等毒力相关基因进行检测[19-21]，最近报道[22]有ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等多个毒力相关基因可被检测到，本文参考文献[22-24]中毒力基因相关引物序列，对历年来收集的浙江省散发猪链球菌感染者分离株进行了PCR检测，以了解毒力基因群分布情况。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 28株实验用猪链球菌菌株均为2005-2020年浙江省各地疾病预防控制中心分离上送，分别来自台州(6株)、嘉兴(6株)、宁波(3株)、绍兴(3株)、温州(3株)、衢州(2株)、金华(2株)、杭州(1株)、湖州(1株)、丽水(1株)10个地区，病例无集中，非共同暴露，无二代病例及人-人之间的传播，均为历年来浙江省散发猪链球菌感染者分离株。实验对照株大肠埃希菌ATCC 8739标准菌株作为质谱仪鉴定菌株对照用。

1.2 菌株鉴定 所有菌株均采用法国生物梅里埃VITEK 2 Compact高级专家系统及其质谱仪BIOM系统及其质谱仪pVITEK MS V2.3.3系统进行菌种鉴定检测，用猪链球菌分型血清(SSI，丹麦)作血清学玻片凝集试验，以鉴定血清型。另参考文献[24-26]对链球菌属特异性tuf基因、猪链球菌种特异性16SrRNA基因与血清型2型Cps2J、7型Cps7H及9型Cps9D鉴别检定基因分别进行PCR检测，以期相互佐证实验鉴定结果，PCR引物见表1。

1.3 菌株DNA提取 挑取SS2单个菌落转种血平板，5% CO237 ℃培养18～24 h，无菌棉签刮取适量，置于装有1 mL灭菌生理盐水的EP管中，上下摇匀，热裂解仪70 ℃10 min后，高速离心去上清，接下来使用QIAamp DNA Mini kit(50)DNA提取试剂盒，按说明书步骤提取猪链球菌DNA基因组，提好的DNA置于4 ℃冰箱以供PCR用。

1.4 主要试剂与仪器

1.4.1 PCR试剂与反应条件 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM version 2.0 plus dye)RR901；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase[Prime STARTMHS DNA Ploymerase、5loymeraseRTMHS DNA P(Mg2+plus)、dNTP Mixture]；DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker均购自宝生物工程TaKaRa(大连)有限公司,反应条件与方法参照试剂说明书。

1.4.2 仪器 法国生物梅里埃VITEK 2 Compact高级专家系统(Systems版本05.01)；法国生物梅里埃质谱仪 BIOM物梅里埃质谱仪act000/100 bp DNA；美国Thermo公司的二氧化碳培养箱；德国Eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR；英国TECHNE DRI-Block DB·2D裂解仪；德国Eppendorf AG22331 Hamburg离心机；美国MiniRun GEL Electrophoresis System BIOER凝胶电泳仪；美国FR-200A全自动紫外可见分析装置。

1.5 引物与合成 参考文献[22-26]合成链球菌属tuf基因、猪链球菌种16SrRNA基因、血清型鉴定基因Cps2J(兼荚膜毒力基因)、Cps7H及Cps9D以及毒力基因mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等引物，所有引物及探针序列交由TAKARA公司/上海生工公司合成，测序交由浙江天科高新技术发展有限公司。PCR扩增条件、退火温度及片段大小均参考相关文献执行，少数引物PCR反应条件需要重新调整，见表1。

表1 PCR扩增引物Tab.1 Primers for PCR amplification

1.6 PCR产物检测 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时用DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker电泳以作对照。电泳产物用FR-200A型全自动紫外与可见分析装置获取图像。

1.7 16S rRNA系统发育树构建 所有菌株均进行16S rRNA全基因测序，测序结果应用DNAMAN软件进行序列拼接比对，对齐序列利用Mega 7.0软件构建16S rRNA系统发育树。

2 结 果

2.1 生化及血清学 取在羊血琼脂培养基上经37 ℃、5% CO2培养20 h的菌落，涂片革兰染色镜检，结果均为长链或短链革兰阳性球菌。取适量纯培养菌落用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统进行生化鉴定，均为猪链球菌，检测可信值均在95%～99.9%。挑取单个菌落分别与猪链球菌分型血清逐个作血清学玻片凝集试验，同时以灭菌生理盐水作对照，所有菌株均与2型猪链球菌标准血清发生凝集，经鉴定所有菌株均为血清型2型。

2.2 质谱仪鉴定 以无菌枪头蘸取单个新鲜菌落均匀涂布于VITEK MS靶板的圆孔中央，再加上1 μL基质溶液，晾干后上机检测。全部菌株经VITEK MS V2.3.3实施基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 技术鉴定检测，同时以标准大肠菌ATCC 8739作为质控对照菌株，28株菌株经MALDI-TOF-MS鉴定均为猪链球菌。

2.3 属、种及型PCR检测 抽提所有菌株DNA，经PCR扩增检测，结果为链球菌属特异性tuf基因、猪链球菌种特异性16SrRNA基因以及血清型2型Cps2J基因(兼荚膜多糖毒力基因)均出现相应大小片段，而对照血清型7型Cps7H及对照血清型9型Cps9D两基因均未有对应条带扩增出。图1为ZJ-6号菌株属、种、型及11种毒力基因PCR检测电泳结果，图2为ZJ-6号菌株另外13种毒力基因PCR检测电泳结果。

M:100 bp DNA Ladder Marker图1 ZJ-6菌株属、种、型及11种毒力基因PCR结果Fig.1 Genus, species, serotype and 11 virulence genes of the ZJ-6 strain, determined by PCR analysis

M:100 bp DNA Ladder Marker图2 ZJ-6菌株13种毒力基因PCR结果Fig.2 PCR results of 13 virulence genes of the ZJ-6 strain

2.4 毒力因子PCR检测 28株菌株经PCR检测，其中Cps2J、mrp、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、lgA1、manN、neuB、pgdA、purD、dpeIV、serum、sortase及sspA共17种毒力基因均被检出预期目的大小阳性条带，检出率为100%；除1株ZJ-31未检测出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61 6种毒力基因目标条带，其它菌株均检测出相应这些毒力基因目标条带，检出率均为96.43%(27/28)；15株菌株(ZJ-8、ZJ-9、ZJ-10、ZJ-18、ZJ-19、ZJ-22、ZJ-23、ZJ-24、ZJ-25、ZJ-26、ZJ-29、ZJ-30、ZJ-31、ZJ-33及ZJ-34)未检出salKR毒力基因目标条带，该毒力基因检出率最低，仅为46.43%(13/28)。图3为28株SS2菌株24种毒力基因检测率竖状图结果。

图3 28株菌株24种毒力基因的检出率Fig.3 Detection rate of virulence genes among the 28 strains

2.5 遗传进化 应用Mega 7.0软件构建16S rRNA系统发育树，树状图结果显示除了1株来自2018年的ZJ-31菌株单独在另一分枝外，其它菌株同源性极高，进化相同均在同一分枝，见图4。

图4 28株菌株16S rRNA基因测序树状图Fig.4 Tree map of the 28 strains, determined by 16S rRNA gene sequencing

3 讨 论

猪链球菌感染呈世界性分布。近年来，基于16SrRNA以及其它保守性较高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、32、33以及34血清型均被排出猪链球菌家族[5]，同时也有新的血清型被发现[27]，可见猪链球菌血清学分型的复杂性。猪链球菌血清型分布有着明显的地域特征，在北美血清型2型及3型是较为常见的血清型，而在欧洲血清型9型却是流行血清型[14,28]，亚洲的泰国、越南及中国台湾、香港等大多流行株为血清型2型[29-34]。目前，在所有血清型中，2型猪链球菌仍是毒力最强、危害最大、流行最为广泛的血清型。1998年江苏和2005年四川人感染猪链球菌病疫情大暴发的病原也是血清2型菌株[35-37]。

研究将本实验室自2005-2020年收集的，来自浙江省10个地市散发病人的分离株进行了复苏。鉴于传统的微生物检测鉴定手段一般都难以用一种手段获得准确可靠的鉴定信息，本次在传统细菌学方法鉴定的基础上，结合近年来发展的蛋白质谱技术以及核酸检测技术对收藏复活菌株全部进行了综合鉴定，共鉴定出SS2菌株28株。需要说明的是，在菌株使用VITEK 2 Compact仪器鉴定时，菌株一定要新鲜菌落，18～20 h培养即可，制作悬液时尽量均一分散，浓度符合，否则鉴定可信值偏低甚至于鉴定为其它链球菌类；MALDI-TOF-MS蛋白质谱仪鉴定结果快速，只要靶板孔内涂菌均匀适量，其他要求不高，不失为实验室快检好帮手。但上述两种仪器检测结果鉴定到种水平，个人认为是可信的，如确定到具体血清型别，仍需结合血清学玻片凝集试验再次确认。有条件的实验室，不妨再结合核酸快诊技术，检测特异性种及型别基因，相互佐证以作综合判断。 不同猪链球菌菌株之间毒力存在差异，如何确定猪链球菌的毒力水平一直以来都是一个难题。比较一致的一个观点是细菌的致病力来自于不同毒力因子在致病过程中的协同作用。因此，相比其它分型方法,基于毒力基因谱的分型方法能够更好的将其与细菌的毒力相关联[38-39]。早期，大多数猪链球菌的毒力因子研究仅集中于mrp、epf和sly，并根据毒力因子的差异，将菌株分为强毒力株(mrp+epf+)、弱毒力株(mrp+epf-)、无毒力株(mrp-epf-)[40]。后来学者们又增进Cps2J、orf2、fbps、gdh、gapdh毒力因子的检测研究。2015年董文阳等[41]报道通过PCR检测101株SS2中的22个毒力相关基因，发现所有菌株被分成两个毒力基因群，其中B群epf、sly、SpyM3_0908、endoD、SMU_61-like和rgg检出率很高，但在A群中检出率低，鉴于单个毒力因子的存在与否很少决定毒力[39]，因此该研究推测毒力因子的特定组合可能至关重要，据此结合毒力实验测试，研究认为B群应为强毒力基因群，揭示了来自中国的强毒和低毒SS2分离株之间的遗传差异。本研究参考上述报道，对28株SS2进行了24种毒力基因的检测，除salKR毒力基因检出率仅为46.43%外，1株ZJ-31菌株(经查为2018年分离)其毒力群基因检测结果与另外27株SS2菌株有明显不同，未检测出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61这6种毒力基因，而其它27株则均有检测出23种毒力基因，这可能与该菌株的遗传进化背景不同相关。鉴于此，本次对28株SS2菌株16SrRNA基因进行了测序，Mga 7.0软件构建16S rRNA系统发育树，分析显示，28株菌株被分成2个进化分枝，其中27株菌株同源性极高归属为同一进化分枝，仅1株ZJ-31菌株另分为一枝进化群，此与上述毒力群基因检测结果似乎相符。结果提示，2005-2018年浙江省猪链球菌病散发流行株携带多个相同毒力群基因，各菌株间虽没有相关的流行病学资料佐证，但通过对16SrRNA基因进化分析，各菌株长期处在一个相对稳定的进化状态，可能各菌株来源背景相同。直至2018年，出现个别分离株其携带毒力群基因有明显不同，遗传进化显示其来源或背景也有明显不同，该变化是否有引起猪链球菌病致病性变化的发生以及流行病学改变，值得我们今后予以持续性关注。