2014-2017年山西省沙门氏菌分子分型及耐药性研究

姚素霞，郝瑞娥，王 洋，张秋香，杨红霞，韩吉婷，秦文彦

沙门氏菌是一种常见的人兽共患病原菌。该菌主要通过污染的食物感染人类，引起呕吐、腹泻等症状[1]。沙门氏菌是全球报道最多、各国公认的食源性疾病所致感染性腹泻的首要致病菌[2]。目前，抗生素在临床及畜牧业中的滥用，出现了大量的沙门氏菌的耐药菌株。但是不同血清型的沙门氏菌耐药性会显著不同，为了解山西省沙门氏菌血清分布与耐药图谱，分析耐药菌株之间的同源性，研究沙门氏菌的耐药机制，本文对山西省食源性疾病监测来源的137株沙门氏菌进行了耐药性检测，并对耐喹诺酮类药物的沙门氏菌进行了耐药基因与分子分型研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2014-2017年山西省食源性病例哨点医院分离自患者粪便标本的沙门氏菌共137株。其中，2014年23株，2015年16株，2016年35株，2017年63株。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 沙门氏菌显色培养基由法国CHROMAgar公司生产，肠杆菌科细菌生化编码鉴定管由北京陆桥技术股份有限公司生产，沙门氏菌诊断血清、Swarm Agar诱导软琼脂由丹麦SSI公司生产，革兰阴性药敏检测板由美国Thermo公司生产，Taq DNA 聚合酶由宝生物工程 (大连)有限公司生产，引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。Seakem Glod琼脂糖由美国LONZA公司生产，蛋白酶K由瑞士Roche公司生产，限制性内切酶XbaⅠ由美国New England Biolabs公司生产，GelRed染料由美国Biotium公司生产。所用试剂均在有效期内使用。

1.2.2 仪器 药敏连续加样仪由美国Thermo生产，PCR 仪由AB公司生产, PFGE系统与凝胶成像系统由美国Bio-Rad公司生产。

1.3 细菌血清型鉴定 137株沙门氏菌根据《食源性疾病监测工作手册》要求进行生化鉴定，依据 《WHITE-kauffmann-Le Minor 抗原表》分型来确定血清型。

1.4 药敏试验 采用微量肉汤稀释法对分离到的137株沙门氏菌进行MIC值测定，药物有萘啶酸、四环素、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢噻肟、庆大霉素、头孢西丁等8种抗生素。结果根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI2017) 标准进行判断。

1.5 耐药基因的测定 耐药基因序列：gyrAF:5′-ACGTACTAGGCAATGACTGG-3′,gyrAR:5′-AGAAGTCGCCGTCGATAGAA-3′;parCF: 5′-CTATGCGATGTCAGAGCTGG-3′，parCR:5′-TAACAGCAGCTCGGCGTATT-3′。采用煮沸法制备DNA模板，PCR反应体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L的dNTP Mix 2 μL， 耐药基因上、下游引物 (10 mmol/L) 各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶0.5 μL，去离子水16 μL。 PCR反应条件：98 ℃变性10 s，55 ℃(gyrA基因为15 s，parC为5 s)，72 ℃延伸 60 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增阳性的PCR 产物经回收纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司进行序列双向测定。所测序列应用 BLAST 软件将测序结果与 GenBank 数据库中的标准菌株Salmonella Typhimurium LT2进行同源性分析比对，确定突变点和氨基酸突变类型。

1.6 PFGE分子分型 根据国家食源性疾病分子溯源网络(TraNet)中沙门氏菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准分型方法进行规范操作。PFGE图像应用Bio Numerics 6.6软件进行分析。

1.7 质量控制 药敏试验的质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922。PFGE分子分型的质量标记选用参考菌株沙门氏菌H9812。

1.8 统计学方法 数据采用SPSS 15.0 软件进行统计分析,计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 菌株情况 137株沙门氏菌79株分离自男性，58株分离自女性，男女比例为1.36∶1；各个年龄段均可感染，中青年组(18～60岁)发病率最高，共分离菌株67株(48.91%)，其次为婴幼儿组(0～5岁)，分离菌株37株(27.01%)。137株菌分离自山西省6个市，大同市56株(40.88%)，太原市23株(16.79%)，长治市22株(16.06%)，阳泉市17株(12.41%)，晋中市15株(10.95%)，临汾市4株(2.92%)。全年均可检出，高峰期为5～10月，共检出111株沙门氏菌，占总检出数的81.02%。137株沙门氏菌经诊断血清凝集后共分为16个血清型，主要为肠炎沙门氏菌51株，鼠伤寒沙门氏菌47株，其他沙门氏菌39株(表1)。

表1 137株沙门氏菌血清分布Tab.1 Serotype distribution of 137 Samonella isolates from patients

2.2 药敏结果 本文选取了8种抗生素的药敏试验，发现137株沙门氏菌对萘啶酸的耐药率最高，为56.93%；其次为四环素，耐药率为34.31%；对头孢噻肟、庆大霉素及头孢西丁的耐药率较低，分别为8.03%、5.84%及0.73%(表2)。比较不同血清型的沙门氏菌对这8种抗生素的耐药性，发现肠炎沙门氏菌对萘啶酸的耐药率明显高于鼠伤寒沙门氏菌，差异有统计学意义(χ2=38.401，P<0.05)；鼠伤寒沙门氏菌对环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素的耐药率高于肠炎沙门氏菌，差异有统计学意义(χ2值分别为34.489，10.319,19.218，均P<0.05)(表3)；肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌对四环素的耐药率差别无统计学意义(χ2= 1.528，P>0.05)，对头孢噻肟、庆大霉素、头孢西丁耐药率都很低。

表2 137株沙门氏菌对8种抗生素的耐药情况Tab.2 Drug resistance of 137 isolated Samonella strains to eight antibiotics

表3 肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌抗生素药敏试验Tab.3 Susceptibility testing of S. enteritidis and S. typhimurium

2.3 喹诺酮耐药基因的测定 从药敏结果中可以看出，沙门氏菌对萘啶酸的耐药率最高，因此我们筛选出对萘啶酸耐药的78株沙门氏菌，进行gyrA基因和parC基因点突变的测定，发现对萘啶酸耐药的沙门氏菌gyrA基因与parC基因检出点突变129个。gyrA基因中最常见突变为第87位氨基酸突变为Asp87Tyr(48.72%)，其次为Asp87Asn(14.10%)、Ser83Leu(7.70%)和Ser83Phe(5.13%)。parC基因中只检出1个突变点，为 Ser80Arg(89.74%)。

2.4 PFGE分型 筛选出对萘啶酸耐药的51株肠炎沙门氏菌与21株鼠伤寒沙门氏菌，分别进行PFGE分析。51株肠炎沙门氏菌的相似度在70.6%～100%，共得到21种PFGE图谱，各带型包含的菌株数不等，E14包含有10株菌，E17包含9株菌，E19包含7株菌等(图1)。21株鼠伤寒沙门氏菌的相似度在58.9%～100%，共得到15种PFGE图谱，各带型包含的菌株数不等，同一带型菌株数最多的为5株(图2)。

图1 萘啶酸耐药的肠炎沙门氏菌聚类分析图Fig.1 Cluster analysis of S. enteritidis resistance to nalidixic acid

图2 萘啶酸耐药的鼠伤寒沙门氏菌聚类分析图Fig.2 Cluster analysis of S. typhimurium resistance to nalidixic acid

3 讨 论

沙门氏菌血清型众多,目前我国发现的血清型达322个[2]。本次研究中,肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门氏菌是山西省人源沙门氏菌感染的优势血清型,分别占 37.23% 与34.31% 。这与我国北京市、河南省等地的报道相似[3-6]，但与广东、武汉等地的报道有所差别[7-8]，说明沙门氏菌感染型别分布可能存在地域差别。

抗生素的广泛使用致大量细菌产生了耐药性，沙门氏菌的耐药情况也非常严重。本研究发现，山西省分离到的沙门菌对一代喹诺酮类药物耐药率最高，达到56.93%，这与文献报道一致[9]，可能与萘啶酸也在上世纪被广泛应用于畜牧养殖业有关。四环素的耐药现象也较为严重，这可能与四环素类药物在不同抗生素之间的交叉耐药明显[10]，以及多西环素和米诺环素在临床的广泛应用有关，也可能与四环素在养猪业的广泛使用，耐药菌株通过猪肉传播给人类有关[11]。环丙沙星作为治疗沙门氏菌感染的一线药物，耐药率为 14.60%，但它的中敏率达到了33.58%，这可能与临床中滥用和不规则治疗关系密切[12]。作者又分别比较肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌对8种抗菌药物的耐药率，发现肠炎沙门菌对萘啶酸的耐药率比鼠伤寒沙门菌高,差异有统计学意义，但鼠伤寒沙门氏菌对环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素、庆大霉素的耐药率均高于肠炎沙门氏菌，差异有统计学意义，这可能与不同型别的沙门氏菌耐药机制不同有关。沙门氏菌耐药现象严重,今后需加强临床用药的科学性和严谨性,减少耐药菌的发生，防止耐药菌株的流行。

喹诺酮类药物通过抑制DNA拓扑异构酶而阻止DNA拓扑异构酶变化，妨碍细菌DNA复制、转录及其调控从而达到抑菌和杀菌的目的[13]。在本研究中，对萘啶酸耐药的沙门氏菌gyrA基因与parC基因检出突变点129个。gyrA基因中最常见突变为第87位氨基酸突变为Asp87Tyr(48.72%)；parC基因中只检出1个突变点，为Ser80Arg(89.74%)。这些突变可能就是导致耐药产生的主要原因[14-15]，但同时我们发现并不是所有耐喹诺酮的沙门氏菌都有基因突变的发生，沙门氏菌对萘啶酸的耐药是一个复杂的机制，更多的机制还有待进一步深入的研究。

PFGE具有分辨能力高，重复性好等优点，是目前细菌分子分型的金标准，它是采用稀有限制性内切酶对细菌进行酶切，通过比对各个酶切条带之间的差别，从整个基因组上来反映菌株之间的关系[16]。本研究采用XbaⅠ酶切,共得到21种PFGE图谱，各带型包含的菌株数不等，51株肠炎沙门氏菌的相似度在70.6%～100%。除2014年的E1、E2、E3型别外，其余型别的相似度达81.6%，说明这些沙门氏菌紧密相关，特别是包含菌株较多的带型如E14、E17、E19、E11之间的相似度达90%以上，说明我省肠炎沙门氏菌可能存在相对集中的亲缘关系。21株鼠伤寒沙门氏菌PFGE分为15个型别，相似度在58.9%～100%，除2017年长治市发生的一次聚集性事件外，鼠伤寒沙门氏菌其它型别之间差异明显,表现出较大的遗传多样性,说明鼠伤寒沙门氏菌具有广泛的来源。