牛结核病诊断技术研究进展

罗鹏飞，舒 展

(阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心,新疆 阿勒泰 836500)

牛结核病(Bovine Tuberculosis,TB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病，袁溶英研究了牛结核病临床症状，其临床上一般难以发现典型症状和病变。Vordermeier H M等学者报道，全球牛结核病流行率为9%。陈淑琼等报道，全球畜牧业的发展中约有5000万头牛患有牛结核病。张喜悦等学者研究发现，我国个别地区牛群中牛的感染率达9.6%，Vordermeier H M等学者报道，全球每年因该病造成的经济损失高达30亿美元。张高迪等学者通过实验发现，牛结核中有7%系人分支杆菌感染，而结核病人中10.6%为牛分支杆菌感染。才吉报道，通过世界卫生组织的实际调查，平均每年会有300万人因患有牛结核病而死亡，不仅对我国经济发展造成了严重影响，而且还对人类生命健康造成严重威胁。潘福宝等学者研究发现，我国人畜结核病虽然在一定时期内得到了控制，但是根据近年来的相关数据，该病的发病率又呈现增长，这应引起高度重视，且应给予大量人力、物力和财力加以防治。

1 牛结核病病原学概述

张秀华等学者报道，牛结核病是养牛过程中较为常见的一种人畜共患性慢性消耗性传染病，其病原是分枝杆菌属的3个种，即牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和禽型分枝杆菌(Mycobacterium avium)。本病会引起牛只多种组织以及器官内出现结节性肉芽肿和干酪性坏死灶，导致机体出现慢性消耗性疾病，病牛普遍寿命缩短，患病奶牛产奶量明显减少甚至出现不孕症状。奶牛是最易感染结核病的家畜，病牛的鼻液、痰液、粪便和乳汁等均可通过空气、经口、撕咬以及垂直传播的方式将疾病传播给人类以及其他动物，引发相关感染。怀孕的母牛可以经过胎盘传播给胎儿，造成新生犊牛感染结核杆菌。牛结核病具备较广的感染宿主，绝大多数温血脊椎动物均可感染。

2 牛结核病研究进展现状

1998年，通过公布结核分枝杆菌H37RV基因组序列的初步分析结果，表明结核杆菌研究进入到了结构以及功能基因组学时代。通过构建牛结核杆菌基因文库，方便分离基因，采取适宜的探针通过分子杂交等即可筛选目的基因。利用牛结核杆菌基因文库来鉴定牛结核杆菌基因及抗原，并对其特征进行分析，即可实现有效的诊断。郑素华等学者研究了牛结核分枝杆菌多肽抗原，通过比较结核分枝杆菌以及牛结核分枝杆菌多肽抗原发现，分子量为28 000、34 000以及40 000多肽为较特异性的多肽抗原成份。

对基因组学进行比较是一种有效的鉴定遗传变异的方法，通过遗传变异可比较出生物体在生理、生化以及毒力等方面所存在的差异。通过公布结核杆菌全基因组序列，使人类得以利用定制的细菌人工染色体阵列作为模版，以不同结核杆菌全基因组作为探针来开展杂交试验。

病原菌在侵害机体时，常常遭到吞噬细胞的吞噬，菌体类脂质可以对吞噬细胞溶酶体的作用进行有效对抗，在吞噬细胞内以细菌的形式寄生。接着形成带菌免疫，这种带菌免疫主要为细胞免疫，导致传染性免疫以及传染性变态反应同时产生并且同时存在。何昭阳等学者报道，在肉芽形成以后，随着病情的发展逐渐转变为肿瘤状的结核结节增生，导致结节异常增大。在肉芽的生长作用下坏死灶逐渐蔓延至心肌部位，其中心部门逐渐缩小，同时因发生钙化以及液化而转变为呈干酪状的团块。哺乳动物体内的结核结节常常转变为致密性的纤维组织，导致该病停止发展。在淋巴液以及血液的流动作用下，结核分枝杆菌发生转移并且其他器官以及组织中定居，导致其他结核结节区的形成，引起器官病变，虽然病变广泛分布，但是在相当长的一段时间内其病理变化并不明显，不存在任何临床症状,随着结核感染大量进入淋巴液以及血液,肾脏以及肺脏等主要器官中逐渐形成大量的结核结节，这一过程属于致命的感染。从早期感染往往需要经过几个月才能出现钙化以及液化的干酪结节，宿主相关免疫应答反应机能、潜伏期内细菌的增值程度直接决定着该病的抑制、发展、病灶的蔓延扩大。

如果机体具备较强的抵抗力，吞噬细胞内的细菌就会在局部滞留导致原发性结核结节的出现，这种结节可能终身不扩散。但是如果机体抵抗力较弱，细菌常常在淋巴管的扩散作用下继发结核结节病灶，在血液的作用下甚至导致全身性结核结节的出现。

结核杆菌可以导致超过50种哺乳动物以及25种禽类发病。牛是最容易感染结核病的家畜,尤其是奶牛其发病率最高，其余分别为水牛以及黄牛，除了牛只外，猪、家禽也容易感染结核杆菌,羊以及马感染概率较低。在全世界范围内牛结核病均有发生，该病的发生不存在明显的季节流行性，可常年发生。其主要传染源为病牛，病牛呼吸道内的分泌物可以通过咳嗽传播至空气当中，或者随着生殖器官分泌物、鼻液、乳汁、唾液、痰液等排出体外，对空气、饮水以及饲料等造成污染。绝大多数情况下，成年牛通过被污染的尘埃或者飞沫而感染，犊牛则主要经过饮水、饲料以及乳汁等感染。

崔基贤等学者报道，在全世界范围内牛结核病均有发生，随着消灭牛结核病计划的顺利，截至到当前美国基本已经不存在结核病牛群。但是人类结核病、野生动物结核病以及观赏动物结核病的存在，导致牛只随时可能遭到感染，因而在美国牛结核病仍受到了较高的重视。2003年，我国从美国引入142头良种奶牛当中，广东检验总局供检验出19例阳性种牛，使得美国25年来不存在牛结核病的神话彻底打破。

在我国，很早以前就有牛结核病的记载，尤其到了上世纪40年代以后，由于从国外大量引入奶牛，导致家畜结核病在我国广泛流行。上世纪50年代我国大规模暴发牛结核病，通过人们的长期不断努力，牛结核病阳性率明显降低。到了70年代,我国奶牛产业得到了快速的发展，随着养殖规模的不断扩大，牛结核病广泛流行，一些地区牛结核病阳性率甚至达到了64.7%。到了80年代，该病的流行逐渐放缓，但是其感染率仍然较高。在我国，牛结核病的发生造成了经济损失。

3 牛结核病诊断研究进展

当前，国内外对于牛结核病的检测方法主要包括细菌学检验、免疫学检验及分子生物学方法3种。

3.1 细菌学检验

Wolf A J等学者研究了牛结核分枝杆菌的细菌学检验，首先为细菌培养以及涂片镜检等病原学检查方法，这是较为常见的一种方法，但是结核菌需要8周左右这一较长时间内进行培养。李树春研究报道，在进行牛结核分枝杆菌的细菌学检验时大约有10% ～ 20%的病例存在培养失败的问题。与此同时，细菌培养的检出率较低，其敏感性较差，加之郭海晏等学者(2002年)报道，其缺乏敏感性及特异性，无法使当前牛结核病的临床诊断需求得到满足。

3.2 免疫学方法

免疫学方法是临床诊断中得到广泛应用的一种诊断方法，较为常见的为牛结核菌素PPD皮内变态反应试验以及间接ELISA检测方法，这两种诊断方法敏感性较高，特异性较强，操作简便，可以应用于牛结核病的普查。当前，牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验已经在牛结核病的检疫诊断中得到了广泛的应用。Cousins D V等学者报道，ELISA法、PCR方法也是较为常见的一种实验室诊断方法，虽然其操作较为便利，但是需要较高的检测成本，因而很难实现有效的落实以及推广。

3.3 分子生物学方法

主要包括PCR、核酸探针以及DNA图谱等分子生物学方法。这一类方法具备较强的敏感性以及特异性，但是其检测过程中需要特殊的仪器设备，检测技术性较强，操作过于复杂，对操作人员以及实验室条件提出了较高的要求。因此，仅仅在实验室研究有所应用，很难在基层推广使用。

牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验虽然具备明显的不足之处，但在实际生产应用当中，杨光旭等学者报道，牛型结核菌素皮内变态反应是国家动物结核病检疫行业标准。当前，这种方法在动物结核病以及人结核病免疫诊断时得到了广泛的应用。张玉环报道，世界动物卫生组织(OIE)和我国都将此方法列为牛结核病检疫的一个标准试验。ELISA方法以及抗体免疫金标方法等其他检测牛血清抗体的方法，均因成本过高，同时操作不便，无法在兽医临床试验得到有效应用。何昭阳等学者比较了ELISA方法与变态反应方法检测奶牛结核病的情况，得到的结论为：变态反应阳性并不能全包括ELISA阳性，变态反应与剖检及细菌学检查的符合率分别为18.8%和7.2%。陈颖钰等学者报道，目前ELISA方法以及抗体免疫金标方法等其他检测牛血清抗体的方法仅被作为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验的辅助诊断方法。

4 展望

牛结核病作为一种慢性消耗性传染病，其传染性较强。近年来，我国养牛产业得到了迅速的发展，牛群数量的增加在一定程度上提高了各种传染性疾病发生的概率，如果未及时采取行之有效的措施对人畜共患病进行综合防控以及净化，会在很大程度上威胁社会公共卫生安全。由于结核病存在细胞免疫和体液免疫分离现象，无论是牛型结核菌素PPP皮内变态反应试验、γ-干扰素体外释放试验还是聚合酶链式反应(PCR)法都难以准确无误地诊断牛结核病，目前确诊牛结核病比较理想的方法是两种或两种以上方法的联合使用。因此，今后除需要在使用现有方法或技术诊断牛结核的基础上，继续开展牛结核病诊断新方法、新技术的试验研究，最大限度地提高诊断的准确性，尤其是在农牧区应用准确、高效、快速的牛结核病诊断方法或技术至关重要，开展牛结核病流行病学调查不仅可以帮助兽医人员掌握牛结核病流行趋势，还能有效预防该病的传染。