超声微泡介导微RNA治疗肝细胞癌的研究进展

邹云雷，刘小慧，赵 云，刘朝奇，刘爱华*

(1.三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443000；2.重庆市梁平区妇幼保健院超声科，重庆 405200)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是临床常见恶性肿瘤之一[1]。肝移植和外科手术是治疗早期HCC的最佳选择，但由于移植器官供体缺乏、复发风险高，且多数HCC确诊时已为晚期，导致仅有小部分患者获益于上述治疗方法。经导管动脉化疗栓塞术为治疗中期HCC最常用的方法[2]，但栓塞所致缺血性损伤及药物非特异性毒性可能进一步损伤肝功能。分子层面的靶向基因疗法正在成为治疗各期HCC的新策略，调控特异性微RNA(microRNA， miRNA)水平能控制HCC进展[3]，可于超声引导下将药物或基因传递到靶器官。与传统基因载体相比，超声微泡用于传递非侵入性基因或药物的安全性、稳定性及转染效率均较高[4]，已有研究[5]将超声微泡用于治疗胰腺癌，并验证了其安全性及有效性。本文对超声微泡介导的miRNA治疗HCC研究进展进行综述。

1 超声微泡介导miRNA转染机制

1.1 超声空化效应 超声和微泡介导的空化通过声穿孔在血管壁上产生短暂或永久性的孔而显著增强ROI内药物浓度[6]。空化效应指微气泡在高、低压超声波交替作用下产生的膨胀和收缩。微气泡在声场中稳定振荡，可见稳定空化现象；微气泡剧烈膨胀或崩塌时，即产生惯性空化现象。稳定空化和惯性空化对邻近组织施加机械力时，惯性空化的微泡溃灭导致额外的撞击效应，如冲击波和液体喷射，进一步增强超声的空化效应[7]。目前相关研究主要针对孤立环境中的单个微泡动力学，却很少关注体内多个微泡及其与周围环境的相互作用。微泡间的距离或微泡与边界间的距离均可影响空化现象，距离较小时会限制微泡膨胀，从而减轻空化效应。2个或多个膨胀的微气泡可在高压超声下合并成单个微泡，称为融合微气泡；这种空化会产生更大的机械力并导致更大的孔径，但也可能增加组织损伤范围[8]。

1.2 肿瘤的高通透性和滞留效应 与正常组织相比，恶性肿瘤血管系统渗透性更强、内皮细胞间隙更宽，淋巴引流不畅且静脉回流缓慢，有助于渗透纳米级物质，增加药物在血管外空间滞留或积聚时间；这种高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect， EPR)介导的累积称为被动靶向，10～200 nm粒径纳米粒子可通过这种方式积聚于肿瘤部位，超声成像所用纳米级微泡、纳米液滴(nano droplets， ND)的作用原理亦如此[9]。

2 超声微泡介导miRNA转染的递送方式

微泡介导miRNA的主要递送方式为微泡与miRNA不耦联递送、miRNA或miRNA基因装载于微泡内或微泡壳。微米级微泡仅能到达血管，却无法向周围肿瘤组织渗透，故需采用微泡与miRNA不耦联递送方式，另将miRNA或编码miRNA的基因装载于其他载体。质粒是最常用于构建表达miRNA基因的载体之一，但循环过程中载有基因的质粒极不稳定，可被血清中的核酸内切酶分解。聚乳酸-聚乙醇酸纳米粒(poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles， PLGA-NP)通过超声穿孔进入血管外腔室，被肿瘤细胞迅速内吞后，在细胞内缓慢释放miRNA，可获得持续治疗效果[10]，且具有良好的生物相容性和降解性，是临床所用最有效的聚合物药物递送载体之一[11]。采用亲水分子如聚乙二醇修饰PLGA-NP表面可延长其循环时间。CHOWDHURY等[12]发现载有miRNA的PLGA-NP粒径多为100～150 nm，封装率可达70%；即使在极高浓度下，均未见PLGA-NP对癌细胞和非癌细胞产生明显毒性。

另一方面，将miRNA或miRNA基因装载于微泡内或微泡壳的装载技术较为复杂，目前用于递送miRNA至HCC细胞的微泡载体主要为相变阳离子ND及纳米级阳离子脂质微泡。ND具有微泡声学特性，体内循环时间长，且靶向性、安全性和稳定性均较高。ND粒径<400 nm，可经EPR外渗至周围肿瘤组织，并在循环中保持纳米级液态，直至被超声触发声波液滴汽化转变成微泡。GUO等[13]以超声触发相变且粒径改变的ND递送miR-122至HCC细胞，显著提高了基因递送效率。纳米级阳离子脂质微泡粒径<1 μm，气泡壳主要为脂类物质，微泡内填充氟烷乳剂或氟烷气体。载miRNA基因的质粒可通过静电作用吸附于微泡壳。载质粒纳米微泡可被动靶向肿瘤组织，由EPR介导滞留于肿瘤的时间更长，且纳米微泡易与组织中微气泡结合，进一步增强其声学特性和检测敏感度。

3 超声微泡介导miRNA应用于HCC

3.1 miR-122/反义miR-21 miR-122在各阶段HCC均显著下降，因此上调miR-122可能减缓肿瘤细胞生长，提高肿瘤对阿霉素的敏感度[14]。相反，miR-21在HCC中高表达，以反义miR-21沉默miR-21可抑制HCC细胞增殖、迁移及侵袭，同时减轻其耐药性[15]。CHOWDHURY等[12]将miR-122、反义miR-21分别载入PLGA-NP并经尾静脉注射于小鼠体内，通过超声成像引导超声聚焦辐照小鼠一侧皮下肝癌移植瘤，发现多次重复治疗效果优于单次治疗，且联合应用两种互补的miRNA不仅可显著缩小肿瘤体积、降低HCC细胞增殖、侵袭及迁移，还可提高肿瘤对阿霉素的敏感度。

WISCHHUSEN等[16]观察超声微泡介导miR-122、反义miR-21对免疫活性的Hepa1-6同基因HCC小鼠模型的免疫调节作用，发现超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)联合miRNA治疗可引起短暂性细胞因子风暴；miR-122和反义miR-21通过降低肿瘤的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平而调节肿瘤近端淋巴结中促癌因子IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-6和抗肿瘤因子IL-2、IL-12水平，从而影响免疫微环境；UTMD局部靶向治疗可明显降低治疗侧和对侧肿瘤淋巴结IL-12和IL-17浓度，提示局部治疗引起了系统反应。但该研究仅观察了UTMD介导miRNA释放后24 h内的细胞因子变化，为证实此类假设并了解反复治疗后HCC免疫微环境的长期变化，仍需对更多时间点及多种治疗条件下进行深入研究。除细胞因子谱外，免疫细胞群的特征也可能有助于了解该疗法的免疫调节潜力。

3.2 miR-221/miR-199a miR-221高表达与HCC临床分期、肿瘤包膜浸润及淋巴结转移显著相关[17-18]。实验研究[19]证明miR-221高表达与索拉非尼耐药相关。HCC患者miR-221与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor， CDKN)1B/p27、CDKN1C/p57呈负相关，可通过靶向p27和p57启动肿瘤发生。GUO等[13]以超声微泡将反义miR-221转染至人肝癌细胞(human hepatoma cells， Hep)——G2细胞，发现CDKN1B/p27和CDKN1C/p57表达上调，HepG2凋亡增加。HCC患者miR-199a下降多提示预后不良。miR-199a可通过靶向低氧诱导因子-1a、分化簇44及调节细胞周期，抑制HCC细胞增殖。此外，miR-199a可上调CDKNlB/p27和CDKN1A/p21抑制细胞周期，诱导细胞凋亡。有学者[13]通过超声微泡介导基因转染观察反义miR-21、反义miR-221和miR-199a对HepG2细胞的影响，发现miR-199a可在最大程度上抑制细胞增殖。

3.3 叉头状转录因子P3-miRNA 叉头状转录因子P3(forkhead box p3， Foxp3)可调控调节性T细胞(regulatory T cells， Treg)的免疫抑制功能[20]。SHI等[21]通过UTMD介导的Foxp3-miRNA转染Treg，以降低Foxp3，结果显示Foxp3-miRNA可下调HCC模型小鼠Treg/T细胞比例、IL-10、转化生长因子-β及血管内皮生长因子水平，并上调IFN-γ及IL-2水平，提示其可在体外解除Treg对HCC的免疫抑制功能，通过增强免疫功能和抑制血管内皮生长因子产生，抑制肿瘤生长。目前尚不清楚UTMD介导的Foxp3-miRNA对免疫功能和肿瘤生长的长期影响，并需进一步研究如何调控Treg细胞产生精确的免疫反应及减少Treg细胞，以期增强对于肿瘤的免疫力，而不引起严重的自身免疫反应。

3.4 抑制磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α(phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit alpha， PIK3CA)基因的前体miRNA 编码p110α蛋白亚基的PIK3CA与多种肿瘤的发生、发展密切相关。HCC患者生存率与PIK3CA表达水平相连紧密，HCC中PIK3CA表达高于非瘤肝组织[22]，因此，抑制PIK3CA表达对于治疗HCC具有重要意义。DONG等[23]筛选出4种在HCC下调且抑制PIK3CA表达的miRNA(miR-139、203a、378a及422a)，并构建了高表达载体(前体miRNA质粒)，利用超声触发可相变的载质粒ND，在体外通过声穿孔传递基因治疗荷瘤裸鼠，结果显示前体miR-139和miR-378a可有效抑制肿瘤生长。目前应用前体miRNA联合超声微泡治疗HCC的研究较少。此外，一种前体miRNA可产生不止一种成熟的miRNA，例如miR-17-5p和miR-17-3p均来自同一前体miR-17，靶向位点却不同，可能出现不可预想的结果，有待进一步研究可控性和可行性。

3.5 miR-206联合可溶性程序性死亡因子1 miR-206是强大的肿瘤抑制因子。结合生物信息学预测和分子细胞方法，WU等[24]发现miR-206可通过抑制肝细胞生长因子受体C-Met、细胞周期素D1和细胞周期蛋白依赖性激酶6表达而延缓3种不同Hep的细胞周期，诱导其凋亡及抑制增殖。可溶性程序性死亡因子1(soluble programmed cell death 1， sPD-1)是肿瘤免疫治疗的靶基因，通过阻断程序性死亡因子1(programmed cell death 1， PD-1)/PD-1配体(PD-1 ligand， PD-L1)的相互作用而激活机体免疫系统。HCC中miR-206表达通常显著降低，而靶基因C-Met表达增加。谭妍迪等[25]利用超声介导载miR-206和sPD-1基因纳米微泡治疗小鼠H22肝癌皮下移植瘤，发现sPD-1与miR-206联合治疗可有效阻断PD-1与PD-L1结合，上调干扰素-γ并下调PD-L1，解除T细胞的抑制，提高T细胞及自然杀伤细胞活性，进一步增强细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤作用；基因治疗后，肿瘤组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2， BCL-2)表达降低，BCL-2相关X蛋白(BCL-2 associated X， BAX)表达增加，以联合治疗后更为明显。上述结果进一步证实了miR-206可通过靶向C-Met促进HCC细胞凋亡；miR-206与sPD-1联合可更有效地阻断PD-1/PD-L1信号通路，表现出更好的抗肿瘤效果。

4 小结与展望

超声微泡介导miRNA治疗HCC相关研究虽已取得重大进展，但在复杂多变的机体微环境中实现具有高诊断敏感度、高特异度和良好治疗效果的靶向系统仍面临诸多挑战：①治疗基因的定位和靶向传递是治疗HCC的首要问题；②对超声能量的安全强度、基因治疗的复杂性和不良反应及基因载体和微泡的毒性仍需深入研究；③既往研究采用的超声参数、动物模型和微泡浓度均有所不同，使得结果的可比性有限，亟需开发在治疗期间可监测声学效应、估计靶组织中传递药物量的系统；④进一步优化微泡制备方法，提高其精度、可控性和重复性，以实现标准化。