钛种植体表面银纳米颗粒负载方法的进展

朱俊瑾 王剑

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院修复科 成都610041

种植义齿是牙列缺损、牙列缺失的常见修复方法，其中钛种植体因其高强度、耐用性和良好的生物相容性而广泛应用于种植修复中[1]。但是钛种植体本身不具备抗菌性能，若发生细菌感染并进展至种植体周围炎，则会引起种植体周骨质丧失，组织愈合不良，最终可能导致整个种植治疗失败。因此，需要在钛种植体上构建抗感染表面以增强其抗菌能力，降低种植体失败的可能性。

与牙周炎相似，种植体周围炎中能检出较多的革兰阴性厌氧菌，此外还可检出其他几种微生物，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌[2]。已有研究尝试在钛表面加载抗生素如万古霉素[3]、庆大霉素[4]等，以降低种植体植入后的感染风险，然而，传统的抗生素会因为细菌耐药性而失效，且针对的微生物数量有限，无法对抗多种感染[5-6]，仍会导致种植失败。因此，金属纳米粒子作为抗菌剂的研究受到了广泛的关注。其中，银纳米颗粒（silver nanoparticle，Ag NP）有其经久不衰的生命力，至今约有130年的历史[7]。它的抗菌谱广、耐药性很低，可以杀死多种细菌并在生理条件下保持稳定[8-9]。它可通过与微生物表面直接接触或局部释放Ag+，从而高效杀死细菌[10]。然而研究表明，它对哺乳动物可能具有细胞毒性[11-12]，释放的Ag+会由于对硫、氮的亲和力而干扰细胞活动过程[13]。为此，近10年来研究人员关于钛基表面负载Ag NP方面进行了大量的研究，通过调整掺银方法或添加其他物质，在保证钛种植体高效抗菌性能的同时避免Ag NP的细胞毒性。

本文综述了目前在钛种植体表面负载Ag NP的主要制备方法及其优缺点，并针对如何优化Ag NP的负载量和降低细胞毒性方面进行了方法总结，为钛种植体负载Ag NP的抗菌研究提供参考。

1 物理方法负载Ag NP

常见的物理方法有等离子体浸没离子注入（plasma immersion ion implantation，PIII）和溅射法。其工艺流程简单、快速，得到的Ag NP纯度较高，但是对设备要求较高、生产成本高。此外，由于Ag NP与基材间具有较强的结合力，不易释放Ag+，故物理方法负载的Ag NP主要以接触杀菌机制实现抗菌作用。

1.1 PIII技术

PIII技术目前已广泛应用于各种生物医学材料或设备的表面改性[14]。等离子体源经负高压脉冲在材料基体周围形成一个等离子体鞘层，加速的正离子从各个方向垂直轰击材料基体并注入基体表面，形成一层富集注入元素的改性层[15]。银等离子体浸没离子注入（silver plasma immersion ion implantation，Ag-PIII）可在钛表层形成Ag NP改性层，由于改性层与材料基体间没有明确界限，故Ag NP与钛基体结合紧密[8]，使Ag NP活动受限，避免了Ag+累积释放引起的细胞毒性[16]。该技术还能精确调控注入量与区域，通过调整Ag-PIII参数改变Ag NP的直径，可直接影响Ag NP的杀菌效果。Zhu等[17]发现，粒径呈2 nm和11~12 nm双峰分布的Ag NP，对金黄色葡萄球菌和具核梭杆菌的杀菌效果要明显大于粒径为4~6 nm的Ag NP。然而，通过Ag-PIII负载的Ag NP大多是通过接触杀菌机制，主要对黏附细菌表现出优异的抗生物膜活性，由于Ag+释放少，故对游离细菌的杀菌作用较弱[18]。此外，Ag-PIII工艺带来的牢固结合力，在消除Ag NP毒副作用的同时，还能促进骨形成。特定粒径范围（4~25 nm）的Ag NP可激活大鼠骨髓干细胞中整合素α5调控的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细 胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein ki‐nase，ERK）信号级联，从而促进成骨细胞分化并促进钛的骨整合[18-19]。同时，Ag NP和钛基质间的微电流效应[8]或由电子转移产生的细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）[20]，既赋予钛板较强的抗菌活性，又能促进成骨细胞黏附、生长和增殖。但这也会使得钛样品表面测得的腐蚀电流增加，样品的耐腐蚀能力会略有下降[8,20]。

1.2 溅射法

溅射法作为原子逐层沉积工艺，是在真空室内以电流电离惰性气体，高速气体离子轰击靶材得到溅射粒子，溅射粒子到达基材，并经过吸附、凝结、表面扩散迁移、碰撞结合形成稳定晶核，具有较低的工艺温度，较高的沉积速率和相对较高的膜与膜之间的结合强度等特点[21]。使用直流等离子体溅射，数分钟内可在钛表面形成Ag NP，且随着溅射时间增加，钛基材上沉积的银含量增加。Kheur等[22]使用直流溅射技术，在氮气环境下，5 min内即可在钛盘上沉积6 μg·mm-2的Ag NP，在6 h内实现对黏附的变异链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的强抗菌活性。然而，溅射法产生的抗菌活性主要针对黏附细菌，对游离细菌的抗菌活性并不明确[23-24]，这可能与强结合力导致银释放受限有关。针对物理方法引起的Ag+释放量低等现象，Abuayyash等[25]通过在钛表面相继溅射铂和银，形成以银为牺牲阳极的体系，通过电化学驱动原理促进银的溶解和释放，从而实现对游离细菌更高的抗菌活性，然而该溶解过程会对人间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，hM‐SC）的细胞活力产生负面影响，但作者指出，Ag NP的快速溶解受载银量影响而具有自限性，在它溶解后，组织细胞的黏附可再次发生。

2 化学方法制备含Ag NP涂层

迄今为止，使用化学方法在钛基材上负载Ag NP仍是最广泛、最经济的方法，它对设备的要求不高，一般是将钛基材浸入含有银盐的溶液中，然后用还原剂、紫外光等将Ag+转化为Ag NP，或者采用电化学沉积、自组装技术负载Ag NP。这些方法制备的Ag NP通常与基材间的结合力较弱，因此更容易释放且易氧化生成Ag+，进入细菌体内引起大分子物质（蛋白质、酶和核苷酸）的失活，从而导致细菌死亡[26]，但是其较高的突释量可能带来细胞毒性问题。

2.1 化学还原法

化学还原法是在钛表面制备Ag NP的简单而经济的方法，在水或有机溶剂中，银盐前驱体、还原剂、溶剂、稳定剂在适当条件下反应，在钛表面还原出银单质。硝酸银是使用最广泛的银盐前体，而柠檬酸钠、乙二醇、抗坏血酸、硼氢化钠（NaBH4）、Tollens试剂、N, N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）等则是最常见的还原剂[27]。使用Tollens试剂改性钛圆片，0.05 mg·L-1的Ag+即可对变异链球菌、唾液链球菌、口腔链球菌、血链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等多种细菌表现出较强的抗菌能力，足以抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌，然而浸泡在Tollens试剂中的时间越长，负载的银含量越多，早期突释现象也越明显，当Ag+释放的质量浓度达到0.1 mg·L-1，会使人成骨细胞的活力显著下降[28]。由于化学还原法制备的Ag NP产量低，使用的试剂如NaBH4、DMF等为有毒化学物质，会对环境和生物体构成威胁，近10年来已少有使用。有学者尝试其他更为安全的还原剂，例如Gunputh等[29]提出用δ-葡萄糖酸内酯作为还原剂，通过顺序添加法可在TiO2表面将AgNO3还原为Ag NP，细菌实验表明其载银钛样品具有强抗菌性能，然而其生物细胞安全性仍需进一步的研究。

2.2 光还原法

光还原法一般是用紫外光对浸没在AgNO3溶液中的钛基材照射30~60 min，从而将钛表面Ag+转化为Ag NP[9,30-34]，可在钛表面均匀分布[31,34-35]。该方法避免了化学试剂的不良反应而逐渐受到人们的推崇。然而这样负载的Ag NP量较少，且与钛表面的结合力弱，容易出现早期突释现象，无法赋予钛种植体长期的抗菌性能。基于此，学者们[36-37]对钛基材表面进行阳极氧化，通过形成均匀有序的TiO2纳米管（TiO2nanotube，TNT）阵列，将Ag NP容纳于内部来增加Ag NP的负载量，杀菌效果可长达30 d。此外，学者们也尝试在钛基材上增加负电荷来负载更多的Ag+。一些学者[9,33]根据氧化石墨烯（graphene oxide，GO）带负电荷的性质，在钛板上电镀GO，通过增加GO浓度可增加负载的Ag+含量，然后经紫外光还原形成Ag NP，从而使钛样本表现出较强的抗生物膜黏附性能和抗菌性能。然而细胞实验[33]表明，载GO-Ag的钛板会影响大鼠骨髓间充质干细胞的细胞活力。

2.3 电化学沉积法

电化学沉积是指在电场作用下，通过电解质溶液的化学反应，使溶液中的离子沉积到阴极或阳极表面上形成薄膜或涂层的过程，需要控制溶液pH值、温度、浓度、电流等条件来控制沉积层的厚度、组成及结构等。其操作简单、成本低廉、环境安全，但是制备理想的、复杂组成的薄膜材料较为困难，应用不当的参数会使材料表面载银异常。在高电压、高电流、长时间及高浓度Ag+条件下，制备出的载银试样表面会附着大小不均的银颗粒，且附着强度低，甚至无法耐受超声清洗[38]。然而有研究[39]表明，在银层表面进一步涂覆羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）可减少银的脱落率，提高钛样品的抗菌性能。使用阳极氧化和电沉积法在钛种植体上制备含银的超疏水性表面可降低Ag+的早期突释，同时抑制细菌黏附[40]。

2.4 自组装技术

自组装技术是一种以基本结构单元自发形成有序结构的绿色、经济的技术。使用逐层（layerby-layer，LBL）自组装可在基板上涂覆功能性薄膜，该方法通过沉积带相反电荷的聚电解质的交替层[41]，可在钛表面构造含Ag NP的连续抗菌涂层[42-43]，具有简单、成本低等优点，但涂层稳定性仍需改善。Zhong等[42]以相转移溶菌酶作为钛表面底漆，然后通过自组装技术以壳聚糖/透明质酸负载Ag NP，形成的抗菌涂层可在4 d内完全杀死非附着细菌和附着细菌，14 d后的抗菌效果也可达65%~90%。但是随着含银量增加，溶液中累积的银浓度升高，样品的细胞毒性越明显。然而，当Zhang等[44]以LBL技术将多巴改性的藻酸盐/壳聚糖涂覆在钛合金表面，然后将Ag NP原位沉积在多层结构中，由于多巴改性后的涂层具有儿茶酚等较多的有机官能团，更具生物相容性，因此在实现抗细菌黏附作用的同时，能够提高细胞活力。

3 生物方法制备Ag NP涂层

生物方法主要使用生物分子的黏附性能负载Ag NP，其反应条件温和，具有生产成本低、绿色环保等优点，但投入时间较长，通常需要花费数天时间。

海洋生物贻贝可以牢固地黏附在大多数基质上，强大黏附力的关键因素是贻贝蛋白质结构中多巴和赖氨酸富集蛋白，其中，含儿茶酚的多巴及其衍生物不仅可以牢固附着在材料上，形成稳定的表面涂层，并且还可以充当还原剂还原金属离子[45-47]。聚多巴胺（polydopamine，PDA）可将Ag NP装载到钛板上或TiO2纳米管上以杀死细菌[47-48]，90 °C水浴条件可明显缩短形成PDA涂层的反应时间[47]。Cheng等[49]通过合成水溶性的含儿茶酚胺的壳聚糖（chitosan，CS），在钛板表面形成涂层，然后浸泡于17 mg·mL-1AgNO3溶液中，将表面Ag+原位还原，抑菌数量达3个数量级（金黄色葡萄球菌量从107到104，大肠杆菌量从106到103），且未发现明显的细胞毒性。此外，多巴胺及其衍生物还能够在材料表面黏固一些生物活性物质（如HA、CS和金属基质）形成杂化涂层，赋予钛种植体更好的抗菌活性、生物相容性和促成骨活性[30,47,50]。例如，CS上带有丰富的氨基和羟基，可作为金属离子的结合位点[51]，充当Ag NP和Ag+的理想螯合剂[52]，发挥稳定释放Ag+的作用。

4 多种技术复合运用以优化Ag NP 的负载量和降低细胞毒性

目前，在钛种植体表面负载Ag NP的方法众多，但主要是围绕Ag+早期突释、释放时间较短引起的远期杀菌能力弱和潜在的细胞毒性问题展开，负载的Ag NP应在有效杀灭病原体和组织生物相容性之间达到平衡。故在前述负载方法的基础上，学者们复合多种技术来优化Ag NP的负载情况，主要从优化负载量和降低细胞毒性两方面进行改良。

4.1 优化钛种植体上Ag NP的负载量

使用化学方法负载Ag NP通常会存在Ag NP负载量不足或负载不稳定等问题，故多数学者对钛种植体表面进行结构设计，例如使用阳极氧化、等离子体电解氧化（plasma electrolytic oxidation，PEO）等，在钛基材上形成具有微/纳米孔隙的钛氧化物层，充当Ag NP的储层，并通过前述的负载方法，从而增加Ag NP的负载量和负载稳定性。若结合选择性激光熔化（selective laser melting，SLM）技术，在Ti-6Al-4V种植体上设计合理的多孔结构，可明显增加Ag NP附着的表面积，Ag+释放时长可持续至少28 d，获得更强的杀菌效果和抗生物膜形成能力[53-54]。类似的，优化负载Ag NP的涂层表面积和形态也可提高载银效率，Tian等[55]通过在Ti-6Al-4V钛合金基底上制备具有定向块阵列的HA涂层，改变了表面电荷和比表面积，提高了载银效率，并具有较强的杀菌和抗生物膜形成作用，还能促进成骨细胞生长黏附、分化和矿化。此外，在钛表面形成具有较强黏附力的涂层以增加Ag+的附着也是常用的方法， PDA涂层常用以黏附Ag+，它以儿茶酚作为溶液中Ag+的螯合剂，在钛样品充分浸泡于银盐溶液中后，结合紫外光还原法，可在表面沉积更高密度的Ag NP[32,47]。另外，通过提高Ag+的还原效率也可增加钛种植体上Ag NP的负载量。

4.2 降低Ag+的细胞毒性

首先，设计合理浓度的含Ag+溶液进行Ag NP负载是必要的，在此基础上，可选择具有强黏附力的物质（如PDA）作为载银涂层，或在含银涂层上继续加载生物活性物质（如CS[30,34]、HA[56]），或者二者兼施以减缓银的释放。Xie等[50]在载银前后分别涂覆PDA和CS，该双重螯合作用显著降低了杂化涂层中银的释放。Yuan等[36]在基于壳聚糖的氨基与海藻酸盐的醛基之间的共价结合和LBL的静电相互作用，将壳聚糖和海藻酸盐加载到载有Ag NP的TNT阵列上，完全覆盖TNT-Ag的纳米孔结构，有效防止初始阶段的Ag+突释，能显著降低细胞毒性，同时抑制细菌黏附。

此外，添加某些金属元素或可降低Ag NP的细胞毒性。有研究[21]报道，在载银钛板上加入锶（Sr）元素，可减轻Ag潜在的细胞毒性，同时保持其最佳抗菌性能。这与Sr竞争性地占据了细胞上特定的结合位点有关。同时引入Sr和Ag还可显著改善改性层的耐蚀性。此外，在钛植体上同时载入锌（Zn）和Ag，可降低Ag+的释放速率，这是由于Zn的掺入会减少Ag的负载，并且钛种植体表面Zn与Ag的微电流耦合作用可抑制Ag NP氧化及随后Ag+的释放，然而这并不影响钛样品的抗菌性能，结果[54]显示种植体周围仍能形成抑菌区。

5 小结

在钛种植体上加载Ag NP对于预防种植体周围炎的发生及进展十分重要，目前已有多种技术用于负载Ag NP，包括物理方法、化学方法和生物方法，尽管各方法仍存在些许不足，但研究人员通过调控钛基或钛基上载银涂层的结构形态，加入其他成分如生物活性物质或金属元素等，结合多种技术，可调节钛基表面Ag NP的负载量及涂层的稳定性，控制Ag+的释放，提高了抗菌效果且减少或避免了细胞毒性。目前，关于探究载Ag NP钛种植体对体内环境影响的研究逐渐增多，人们可以更加充分地认识到Ag NP的抗菌效果和细胞毒性风险，随着现代经济技术的快速发展，在钛种植体上实现低成本、高效率地负载含Ag NP涂层的趋势也有助于加快这一研究进程。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。