哺乳动物卵泡相关代谢组学研究进展

毛菲，冯睿芝，钱云

近年随着生活环境、社会压力等因素的改变，人群不孕不育的发病率越来越高[1]。我国目前有25%的育龄夫妇受到不孕不育的困扰[2]，辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的发展为众多不孕不育家庭带来了希望。而辅助生殖周期的成功高度依赖于精卵质量和胚胎质量，其中卵母细胞质量是决定妊娠结局的一项重要因素[3]。目前用于评估卵母细胞质量的主要方法尚停留在形态学阶段，但这些带有主观性的形态学指标并不能完全代表卵母细胞的发育潜力。新兴的代谢组学研究有望为评估卵母细胞质量提供新方法，已有研究证实不同状态下的卵泡代谢存在较大差异[4-5]。卵母细胞周围的颗粒细胞及卵泡液作为卵母细胞生长发育微环境的重要组成部分，对卵母细胞的成熟和发育都具有重要意义。充分了解卵母细胞及颗粒细胞相关的代谢，筛选出标志代谢物，有助于更好地评价卵母细胞质量，提高妊娠率。现综述近年哺乳动物卵泡代谢组学的研究进展，探讨卵泡细胞代谢的特点，以期为临床不孕症的诊断和治疗提供新的思路。

1 代谢组学与女性生殖

代谢组学是指对中小分子物质进行定性和量化，被广泛认为是最接近表型和功能的组学。与基因和蛋白相比，代谢物更加容易获得，结构相对简单，易于筛选[6]。另外，代谢物位于基因功能的下游，能在生理水平上更好地衡量细胞活动。由于代谢组学固有的敏感性，可以检测到生物事件中细微的变化，它的出现为深入了解体内各种生理、病理过程（包括疾病）提供了条件。

近年代谢组学技术飞速发展，核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）、气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液 相 色 谱-质 谱 联 用 技 术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）已被广泛应用于女性生殖方面。目前与女性生殖相关的代谢组学研究对象主要包括卵母细胞、颗粒细胞、卵泡液、卵母细胞培养液、胚胎培养液和子宫内膜液等。多种女性生殖相关疾病如多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、肥胖和子宫内膜异位症等引起的不孕已被证实与一些差异代谢物有关[4，7-8]。因此，代谢组学在寻找女性不孕相关机制、筛选标志物和临床诊断方面均有广泛的应用前景。

2 卵泡相关代谢组学研究

女性出生时卵巢原始卵泡池已存在，阻滞在第一次减数分裂（meiosisⅠ，MⅠ）前期的初级卵母细胞被单层梭形的前颗粒细胞和基底膜包绕形成原始卵泡，这是女性生殖的基本单位，也是卵母细胞的储备形式。部分原始卵泡因刺激激活后形成初级卵泡，其周围有一层立方形的颗粒细胞[9]。在颗粒细胞层逐渐增加后形成次级卵泡。在卵泡增大的过程中，卵泡内逐渐形成卵泡腔。当卵泡腔达到一定大小时，在促性腺激素的刺激下，部分卵泡发生排卵。此时的卵母细胞恢复减数分裂，排出第一极体形成第二次减数分裂（meiosisⅡ，MⅡ）中期的卵母细胞，并在输卵管中等待受精。

2.1 卵母细胞代谢组学研究研究表明卵泡的代谢会随着卵泡的发育进展而动态变化[5，10-11]。卵母细胞质量是决定妊娠成功与否的关键因素，充分了解其本身的代谢情况对筛选优质卵母细胞至关重要。然而，由于代谢组学研究需要大量的样本，而卵母细胞取材相对困难，因此针对卵母细胞本身的代谢组学研究相对较少，近年才有所发展。

为获得卵母细胞本身发育过程中的完整代谢图谱，Li等[5]首次对处于生发泡（germinal vesicle，GV）期、生发泡破裂（GV breakdown，GVBD）期和MⅡ期的卵母细胞进行了代谢组学分析。研究者主要聚焦于脂质代谢，发现两种完全不同的脂质代谢模式。与未成熟的GV期卵母细胞相比，GVBD期的卵母细胞中肉碱和棕榈酰肉碱的水平显著升高，而其他大多数脂质代谢相关产物（即花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等）随着卵母细胞减数分裂进程而减少[5]。脂肪酸β-氧化被认为对小鼠卵母细胞的成熟具有重要意义，肉碱和棕榈酰肉碱是β-氧化的相关代谢物，肉碱是将脂肪酸从细胞质运输到线粒体的必需物质，其抗氧化作用也有益于卵母细胞的发育，具有调节女性生殖系统氧化代谢状态的功能[12]。补充左旋肉碱已被证明可以改善衰老、PCOS和子宫内膜异位症等生殖相关因素引起的卵母细胞质量下降[13-15]，显著改善辅助生殖的妊娠结局[16]。因此，有学者对其进行了深入研究，蛋白质组学显示在卵母细胞成熟过程中肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ水平显著上调，脂肪酸降解相关酶在MⅡ期卵母细胞中也显著增高[5]，表明在小鼠卵母细胞成熟过程中脂肪酸的利用增强。相反，在培养液中添加花生四烯酸会影响卵母细胞纺锤体形成和染色体排列，从而阻碍其成熟[5]。二十烷类化合物由花生四烯酸合成，用于合成前列腺素和白三烯，促进卵母细胞减数分裂。在卵母细胞成熟过程中，氨基酸代谢也发生了显著变化，丝氨酸、谷氨酸和组氨酸的含量在减数分裂恢复期显著增加，在成熟卵母细胞中减少[5]。研究表明一方面卵母细胞可利用丝氨酸合成谷胱甘肽以减少氧化应激；另一方面，丝氨酸可用于卵母细胞的一碳代谢以合成核苷酸[5，17]。研究已知在卵母细胞成熟过程中，碳水化合物代谢逐渐增强，主要富集于三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环）和磷酸戊糖途径[5]。TCA循环在卵母细胞发育过程中产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），用于纺锤体的组装和染色体的运动。该研究中，糖酵解相关代谢物和相关酶的水平未发生明显变化，相比之下，磷酸戊糖途径的关键代谢产物葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖酸内酯在卵母细胞成熟过程中增加了约30倍，葡萄糖醛酸增加约10倍，降低关键酶的表达后卵母细胞发育停滞，证实了磷酸戊糖途径对于卵母细胞发育具有重要作用[5]。而Xie等[18]发现与敲低3-磷酸甘油醛脱氢酶相比，敲低卵丘细胞中的磷酸戊糖途径关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶后，卵母细胞质量下降更加显著。因此，相比较于糖酵解途径，磷酸戊糖途径可能对于卵母细胞的成熟具有更加重要的作用[5，18]。Li等[5]建立了整个卵母细胞在体内成熟期间的时间代谢图谱，并利用蛋白质组学研究以支持代谢组学数据，为后续的研究提供了一个有力的理论支持。

2.2 颗粒细胞代谢组学研究卵母细胞与颗粒细胞的双向通信对于卵母细胞正常生长发育至关重要。一方面卵母细胞周围的卵丘细胞可以通过缝隙连接直接与卵母细胞相连，为两者之间的分子交换提供条件；另一方面两种细胞均会产生旁分泌因子来调节卵母细胞的生长和颗粒细胞的增殖与分化。由于颗粒细胞在临床取样过程中易获得，收集颗粒细胞进行代谢标志物的检测不会对卵母细胞本身的质量造成损伤。因此，对颗粒细胞代谢的进一步研究有望为无创评估卵母细胞质量提供新方法。

卵丘细胞与卵母细胞在代谢上存在重要的协同作用[10，19]。Uhde等[10]认为卵母细胞在卵丘细胞存在的条件下进行体外培养后，卵母细胞的发育潜力更高，而卵丘细胞产生的代谢物肉碱可能是其中一项关键因素。Li等[5]的研究证实在卵母细胞减数分裂的过程中，卵母细胞中的肉碱含量升高，卵丘细胞能够分泌关键的代谢产物以满足卵母细胞减数分裂的需求。另有研究发现，卵丘细胞中的TCA循环中间体随培养时间的延长逐渐减少，而培养液中的这些成分却随时间增加[10]。牛卵母细胞在与草酰乙酸和苹果酸共培养体外成熟时，MⅡ期卵母细胞的比例会显著增加[20]。因此，在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞还可以向卵母细胞提供草酰乙酸、苹果酸等氧化代谢中间体，维持氧化还原平衡，改善卵母细胞质量。为满足体外培养条件下卵母细胞的需求，卵丘细胞还会调节自身代谢，升高糖酵解比例，增加脂质的合成，减少脂质的氧化，提高氨基酸的合成来满足卵母细胞的代谢需求[19]。综上，卵丘细胞在卵母细胞体外成熟的过程中，通过代谢协同作用为卵母细胞创造了一个有利的微环境，并为卵母细胞后续的发育提供能量和其他的小分子物质，它们之间存在复杂的相互作用。

2.3 卵泡液代谢组学研究在人类辅助生殖周期中，虽然会根据个体差异选择不同的促排卵方案，但仍会出现卵泡发育不一致、大小差异较大的情况。既往研究认为大卵泡中获得的卵母细胞的发育潜能高于小卵泡中的卵母细胞，因此临床取卵时应选择相对较大的卵泡[21]。然而，近年越来越多的研究者认为卵泡的大小与卵母细胞的受精率及胚胎发育率无明显相关性[22-23]。因此，单纯通过卵泡大小来判断卵母细胞质量缺乏可靠依据。卵泡液由血浆通过血液卵泡屏障转移的小分子物质、颗粒细胞以及膜细胞分泌的代谢物组成，为卵母细胞发育提供了微环境。可以合理地认为，卵泡液的某些生化标志物可以反映卵母细胞质量、受精能力及随后的胚胎发育潜能。由于卵泡液获取方法相对简单，且不影响卵母细胞本身的质量，寻找卵泡液中的代谢标志物评估卵母细胞质量将更有预测价值[24-26]。

卵泡液中的脂质代谢物种类繁多，近年来多项研究关注于脂质相关代谢对于卵母细胞质量的影响[11，25-26]。脂肪酸是脂质的一种，对卵母细胞质量有重要影响。人卵泡液中最丰富的脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸[27]，棕榈酸和硬脂酸为饱和脂肪酸，油酸、亚油酸为不饱和脂肪酸。研究表明培养液中添加高浓度的棕榈酸会通过增加卵母细胞和颗粒细胞中的脂质和神经酰胺，诱导内质网应激和线粒体功能障碍，导致颗粒细胞的活力和增殖能力降低，继而降低卵母细胞质量[28-29]。在肥胖母马的卵泡液中，硬脂酸浓度升高会抑制颗粒细胞的增殖，诱导凋亡[30]。而在复发性流产患者的卵泡液中，油酸的含量下降[31]，油酸能够降低饱和脂肪酸对卵母细胞发育的不利影响，且可以调节脂肪酸的代谢和细胞内信号，降低氧化应激，从而促进卵母细胞和植入前胚胎的发育[32]。因此，在卵泡液中，良好的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例对卵母细胞的质量至关重要。卵泡液中的类固醇也被认为对卵母细胞及随后胚胎发育潜力具有重要预测价值。邢亚楠等[33]研究发现，与小卵泡相比，母马大卵泡的卵泡液中的类固醇含量显著上调，类固醇激素是促使卵泡发育的主要代谢物。而脱氢表雄酮为类固醇生物合成途径的一个关键物质，可转化为更活跃的睾酮、雌二醇和雄烯二酮。在复发性流产患者的卵泡液中，脱氢表雄酮含量升高[31]，且被认为与卵母细胞成熟率及优质胚胎率呈负相关[11]，对于妊娠结局具有较高的预测价值。PCOS是育龄妇女最复杂和最普遍的内分泌疾病之一[34]。一项类固醇代谢组学研究显示，PCOS患者卵泡液中类固醇的合成普遍减少[35]。而Sun等[36]发现PCOS患者卵泡液中游离脂肪酸、3-羟基壬酰肉碱和二十碳五烯酸水平显著升高。Chen等[37]则认为PCOS患者卵泡液中的胆固醇产物对卵母细胞质量具有预测价值。因此，生殖相关疾病引起的代谢改变往往是一类物质，使用单一物质来评价卵母细胞质量的可靠性相对较低，多种脂质代谢物联合检测对于卵母细胞及随后胚胎发育的预测价值较高，但仍需要进一步研究以筛选出合适的标志物。

除了脂质，氨基酸也与生殖密切相关。对于繁殖能力低下的母猪，其卵泡液中精氨酸和脯氨酸浓度升高，而代谢产物减少，尿液中则完全相反，表明精氨酸和脯氨酸的利用率降低会导致卵母细胞发育受限，影响繁殖能力[38]。而在卵泡的发育过程中，为满足卵母细胞逐渐增加能量的需求，氨基酸也能够转化为能源物质以支持卵母细胞的发育。天冬氨酸转氨酶在牛卵丘细胞中具有较高的活性，能够将天冬氨酸转化为草酰乙酸，进入TCA循环[10]。天冬氨酸的浓度被证实与获卵数呈正相关，年轻女性卵泡液中的天冬氨酸水平显著高于高龄女性[4]，其浓度的降低与繁殖力降低有关[38]。因此，天冬氨酸可能在卵母细胞能量代谢中起着重要作用，影响女性的生殖能力。另外，研究已证实缬氨酸和亮氨酸均能被卵母细胞消耗用以供能[39]。综上，氨基酸在卵泡的生长过程中具有多种功能，氨基酸水平降低可能预示着某些生殖相关疾病导致的卵母细胞质量下降。

卵泡液代表着卵母细胞及颗粒细胞的生存环境，由于其取材相对简单，较易获得，相关研究较多，但仍未有一个统一的代谢物评价标准。因此，卵泡液中标志物的选择还有待进一步的研究。

3 结语

近年代谢组学正逐渐成为诊断和治疗女性生殖相关疾病的重要方法，对卵母细胞及颗粒细胞的相关代谢研究有助于了解两者各自的生理和病理状态，卵泡液的代谢研究则展示了卵母细胞及颗粒细胞的共同代谢状态及生存环境。由于代谢组学是最接近表型和功能的组学，且代谢物易获得，众多研究者希望从中寻找特殊代谢物质来评价卵母细胞质量。然而，代谢组学研究需要的样本量大，筛选出的代谢物种类多，部分难以鉴别，致使目前代谢组学分析仍然是一项重大的挑战。发展单细胞的代谢组学分析技术，建立标准的通用代谢组学数据库将显著提高对卵母细胞代谢的理解。因此，代谢组学的研究具有重要价值，发展新的代谢组学技术、提高代谢组学的研究效率，有望大幅提高辅助生殖的成功率，改善人群的生育率。