富血小板血浆治疗薄型子宫内膜的作用机制

郑秀丹，尹兰兰，王艳波，马天仲

在辅助生殖技术（assistedreproductive techniques，ART）周期中，成功的着床和分娩取决于子宫内膜的接受能力和胚胎的侵入能力，子宫内膜成熟发育的特异性和精确性对胚胎着床和随后的生长起着关键作用。评估子宫内膜容受性对ART至关重要，而子宫内膜厚度可以作为一个无创参数来推断子宫内膜的容受性[1]。体外受精（in vitro fertilization，IVF）患者中薄型子宫内膜者占1%～2.5%[2]。子宫内膜过薄可导致反复种植失败、体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗周期取消，甚至可能增加妊娠成功后子痫前期、胎盘早剥和小于胎龄儿（SGA）等产科妊娠并发症的患病风险[3]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）作为薄型子宫内膜的新型治疗方法，其确切的作用机制尚未完全明确，现就PRP对薄型子宫内膜的治疗现状以及研究进展进行综述。

1 薄型子宫内膜概述

目前对于薄型子宫内膜的定义尚未达成共识。Liu等[4]的研究表明，在新鲜胚胎移植周期（24 363个）中子宫内膜厚度低于8 mm、冻融胚胎移植周期（20 114个）中子宫内膜厚度低于7 mm时，临床妊娠率和活产率都会下降。中华医学会生殖医学分会在2018年发表的《辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识》推荐，在ART中子宫内膜厚度＜7 mm时称为薄型子宫内膜，但不建议仅依据子宫内膜厚度来评估子宫内膜容受性、预测ART妊娠结局或取消胚胎移植周期[5]。同样，Kasius等[6]进行的一项对IVF患者子宫内膜厚度和妊娠率的系统回顾和荟萃分析也不建议仅仅因为薄型子宫内膜而取消IVF治疗周期。

薄型子宫内膜可能是由多种原因和疾病引起的，其中使用口服避孕药（oral contraceptive，OC）或促性腺激素释放激素激动剂等药物可能导致子宫内膜菲薄，但停用药物后多可恢复正常；而因反复宫腔操作、子宫动脉栓塞术、子宫内膜结核、宫腔感染和子宫内膜炎等造成的子宫内膜损伤以及子宫肌层病变引起的内膜菲薄，往往会形成反复顽固型薄型子宫内膜；此外，原因不明的薄型子宫内膜也并不少见[7]。

对于薄型子宫内膜患者，许多药物用于提高子宫内膜厚度和胚胎着床率，如雌激素、促性腺激素、来曲唑、枸橼酸西地那非、己酮可可碱、维生素E和他莫西芬等，但疗效有限，薄型子宫内膜仍是一个困扰临床的重要问题。近年来，干细胞治疗和宫腔局部药物灌注治疗已成为薄型子宫内膜治疗的研究热点，而PRP灌注治疗因能提供超过生理剂量的必要生长因子，可为愈合潜力低的组织修复提供再生刺激，而成为一种安全性显著的替代方法[8]。

2 PRP概述

PRP为自体周围静脉血经细胞分离，采用血小板分离液和密度梯度离心法分离提取得到的浓缩血小板血浆。在过去10年中，PRP应用的自体细胞疗法已在多种疾病治疗中发挥辅助作用，同时在各种妇科疾病中的应用也有了新进展，如外阴营养不良症、外阴癌重建手术、卵巢早衰、卵巢扭转、难治性子宫内膜异位症和反复种植失败等。PRP在薄型子宫内膜治疗中的确切作用较为复杂，学者们提出了以下几种可能的机制[9]：①通过多种生长因子[包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-βⅠ（transforming growth factoβⅠ，TGF-βⅠ）、表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）]以及刺激多种趋化因子[如CXC细胞趋化因子配体5（CXCcellchemokine ligand 5，CXCL5）、CXCL12]的表达来促进细胞再生、增殖和血管化；②活化的PRP促进了人类子宫内膜干/祖细胞的迁移，如经血间充质干细胞（menstrual blood stem/stromal cell，MenSC）、子宫内膜间充质干细胞（endometrial mesenchymal stem cell，eMSC）和骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）等；③通过化学吸引作用迁移细胞，促进间充质细胞和上皮细胞之间的转化；④通过刺激血小板源生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）/磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路来增加旁分泌因子的水平，减缓细胞凋亡，从而增强细胞再生功能[10]。

2.1 生长因子现今PRP治疗薄型子宫内膜的机制尚未完全阐明，实验室研究表明PRP中高浓度的生长因子可以潜在地加速愈合过程，且PRP优于重组人生长因子，因为血小板激活可释放多种生长因子和分化因子[11]。VEGF、PDGF、TGF-βⅠ、EGF、IGF-1、HGF存在于血小板α-颗粒中，PRP被激活后加速血小板中生长因子的释放，不同制备方法获得的PRP中生长因子的数量存在显著差异，这些差异可能与白细胞的浓度或其产生的因子有关，PRP中白细胞浓度越高，其具有的VEGF、HGF、IGF-1和PDGF-AB浓度越高[12]。已有研究表明，一些生长因子可控制子宫内膜的增殖，例如PDGF能显著促进子宫内膜上皮的增殖、迁移和管状形成[13]；在人类、小鼠和大鼠的子宫内膜中都存在肝细胞生长因子受体（cmesenchymal-epithelia transition factor，c-MET）和表皮生长因子受体（EGFR），这些生长因子受体与配体结合时通过触发多种信号通路，控制细胞从G0期过渡到G1期和从G1期过渡到S期的速度，导致上皮细胞存活和增殖[14]。同时血小板α-颗粒中也含有不同的白细胞介素（interleukin，IL）和趋化因子等，能够刺激细胞趋化和成熟的炎症介质。趋化因子在子宫内膜的生成已经得到了充分研究，例如子宫内膜上皮细胞和基质细胞在其他细胞因子的刺激下产生CXCL5，而CXCL5作为炎症介质可增加单核细胞与内皮细胞的黏附，在控制炎症过程中可能产生有益作用[15]。另外一项对薄型子宫内膜模型小鼠的研究发现，使用CXCL12处理的小鼠子宫内膜上皮面积显著增加，Ki-67和CD31的免疫反应性显著升高，且子宫内膜容受性标志物白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、IL-1β和 整 合 素β3（integrin β3）的mRNA表达水平均升高，证明CXCL12可改善小鼠较薄子宫内膜的生长，并增加间质细胞数量和腺体数量[16]。

2.2 子宫内膜干/祖细胞人类子宫内膜的独特之处在于能够周期性地快速自我再生，子宫内膜基底层可作为产生新功能层的祖细胞来源，有证据表明子宫内膜-子宫肌层边界附近的基底层以及功能性层中存在多个谱系受限的干/祖细胞群[17]，而子宫内膜的干/祖细胞对子宫内膜的再生功能是必要的。Kaitu′u-Lino等[18]采用了标记滞留细胞（label-retaining cell，LRC）技术，如使用DNA合成标志物溴脱氧尿苷（BrdU）对基质细胞或上皮细胞的细胞核进行脉冲标记，在1个有功能的子宫内膜破裂和修复的小鼠模型中检测子宫内膜脉管系统的候选间质干/祖细胞。结果显示，在小鼠子宫内膜修复过程中LRC与血管系统相关的比例明显高于蜕膜前，其中一部分的LRC正在增殖，表明血管周围的LRC可能在子宫内膜的广泛重构中促进了子宫内膜间质扩张，证实了伴随着子宫内膜破裂和修复的血管变化，有一群干/祖细胞参与了子宫内膜间质的增殖和扩张。eMSC可以重建子宫内膜组织，增加子宫内膜厚度，在促进子宫内膜的生长和功能方面发挥着重要作用。而BMSC也可促进子宫内膜再生[19]。Wang等[20]研究发现PRP可以促进eMSC的增殖和迁移，使其向子宫内膜细胞分化，且PRP以剂量依赖的方式诱导细胞增殖和迁移，在2%的PRP剂量时eMSC的增殖达到最大值。相关动物实验证明，在宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）小鼠模型中MenSC和PRP的联合移植能够更有效地促进子宫内膜再生，妊娠率显著提高[21]。这些研究证明PRP治疗可增强子宫内膜干细胞促进子宫内膜生长的效应。

2.3 上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）/间质-上皮转化（mesenchymalepithelial transition，MET）EMT/MET在胚胎发育和恶性肿瘤背景下备受关注，在胚胎发育中，胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）或诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）可通过EMT和MET向体细胞类型分化。分化的体细胞也可以通过连续的EMT-MET被重新编程为多能细胞，MET是获得多能性的关键步骤，但EMT也可能同步并启动细胞重新编程[22]。如今越来越多的研究表明子宫内膜之间的间充质和上皮细胞之间的转换在其正常生理功能中起关键作用，Huang等[23]利用双转基因模型证明，在子宫内膜损伤后，上皮祖细胞继续只存在于上皮间室，而基质祖细胞可分化为基质细胞和上皮细胞，证实了MET在损伤后子宫内膜再生中的作用。Cousins等[24]利用小鼠月经样模型来确定MET在子宫内膜再生中的作用，在人工蜕膜化和停用孕酮后，检测到了上皮和基质细胞同时表达的标志物，并且随着时间的推移似乎更靠近上皮恢复区域的基质细胞群。在孕酮停药和子宫内膜变性24 h内，间质标志物（如N-钙黏蛋白、波形蛋白、Wnt4）的mRNA表达显著下降，而上皮标志物[如角蛋白18（Krt18）、E-钙黏蛋白、Wnt7a]的mRNA表达显著增加，这表明了潜在的MET过程。2020年Agarwal等[25]的研究显示，宫腔灌注PRP后，32例患者中有24例子宫内膜增加至7 mm或更厚，这24例患者后续都接受了冻融胚胎移植，有12例患者妊娠，其中10例临床妊娠，2例生化妊娠，该研究表明在宫腔镜引导下将PRP注射到子宫内膜-子宫肌层连接处可改善薄型子宫内膜患者的内膜厚度。另外一项体外研究表明，活化的血小板促进BMSC、人子宫内膜eMSC和子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell，IC）等子宫内膜细胞增殖和迁移，但没有发现促进子宫内膜基质细胞或eMSC的MET，这是体外和体内结果预期的差异，需要进一步的研究[26]。

2.4 NF-κB信号通路NF-κB是一种存在于多种类型细胞中的重要核转录因子。NF-κB肽由5个亚基组成二聚体，包括RelB、c-Rel、p65（RelA）、p50/p105（NF-κB1）和p52/p100（NF-κB2）。这些亚单位可结合形成不同的二聚体，通过与NF-κB抑制蛋白I-κB结合而保持活性。NF-κB典型通路是由促炎性因子刺激脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或IL-1诱导的，激活I-κB激酶复合物（I-κB kinase，IKK），磷酸化I-κB，并导致p50/p65激活，负责调节先天免疫反应、炎症和细胞生存的基因转录[27]。NF-κB及其不同的激活途径和二聚体在子宫内膜生理学中的作用尚待阐明，但根据其已知的功能，NF-κB可调节子宫内膜炎症、免疫、细胞凋亡、黏附、侵袭和血管生成，NF-κBDNA结合活性存在于健康女性月经周期的所有阶段，在整个月经周期，子宫内膜中NF-κB-DNA的总结合是结构性的和可变的[28]，其p50和p65亚单位、I-κB和IKK在人子宫内膜间质和上皮细胞中表达，而在健康女性增殖期子宫内膜中p65-DNA结合高于分泌期和月经期子宫内膜，增殖期子宫内膜中p65-DNA结合的增强可以使月经周期排卵前子宫内膜细胞增殖增加和凋亡减少[29]，调节子宫内膜凋亡对月经周期组织稳态和组织重塑有重要作用，从而为胚胎的着床做好子宫内膜准备。还有研究表明，在体外培养的子宫内膜异位症基质细胞（eutopic endometrial stromal cell，EESC）以及人月经子宫内膜诱导的子宫内膜异位症小鼠模型中，抑制NF-κB信号通路可通过减少细胞增殖和增加子宫内膜上皮细胞和基质细胞凋亡来抑制子宫内膜异位症病变的进展[30]。Zhou等[31]使用PRP（5 000计数/mL）与BMSC浸泡明胶支架，将其缝合于子宫角损伤的大鼠模型中。研究发现PRP治疗可提高再生子宫内膜组织和培养的BMSC中IL-10的表达，增强骨髓间充质干细胞的三系分化潜能。但是抑制和沉默BMSC的p50可抑制PRP诱导的IL-10的表达和分泌，p50能够直接结合IL-10启动子并促进其表达。这表明PRP治疗改善骨髓间充质干细胞移植后大鼠子宫角损伤的子宫内膜再生的工作模型，可能是通过NF-κB信号通路亚基p50介导，直接诱导IL-10的表达和产生。这进一步证实了NF-κB信号通路在调节子宫内膜细胞增殖和凋亡中的作用。

3 PRP治疗薄型子宫内膜的临床进展

2015年，Chang等[32]进行了首次临床试验，通过宫腔灌注PRP来增加接受IVF治疗患者的子宫内膜厚度。该研究中的5例患者在接受标准激素替代治疗后子宫内膜反应较差，给予PRP宫内输注，每个周期1～2次。5例患者的子宫内膜厚度增加1.1～1.6 mm（治疗后均≥7 mm），4例患者成功妊娠，证明PRP可改善妊娠结局。随后也有一些临床研究发现自体PRP可以促进子宫内膜生长，改善妊娠结局[20，33]。但是这些研究存在样本量小，缺少随机对照等局限性。为了比较不同来源的PRP对不孕症子宫内膜病变的治疗效果，de Miguel-Gómez等[34]抽取了4例Asherman综合征/子宫内膜萎缩患者以及1例正常生育期妇女的血浆，分别运用在子宫损伤NOD/SCID小鼠模型和体外子宫内膜细胞模型中，结果显示所有的血浆样本都含有具有高再生潜力的分子，体外细胞增殖率和迁移率升高，损伤的小鼠子宫组织促再生标志物Ki-67和HOXA10升高，Asherman综合征/子宫内膜萎缩患者的血浆与健康女性并无不同，其所提取出的PRP均具有可用于子宫内膜病变的再生特性。Tehraninejad等[35]招募了85例子宫内膜厚度正常（≥7 mm）但有反复种植失败史的患者，在患者充分知情同意后根据患者的意愿将其分为干预组（PRP，42例）和对照组（拒绝PRP治疗，43例），所有患者均接受激素替代治疗。2组的妊娠结局包括生化妊娠率、临床妊娠率和持续妊娠率（≥20周）差异均无统计学意义（35.7%vs.37.2%，P=0.89；31.0%vs.37.2%，P=0.54；26.8%vs.25.6%，P=0.90），从而推测PRP对于接受胚胎移植的子宫内膜厚度正常的反复种植失败患者来说并不是一种有效的辅助治疗方法。目前许多关于PRP的研究样本量较小，研究设计也不尽相同。关于PRP是否被推荐为临床常规治疗，尚需进一步进行高质量的大型前瞻性随机对照试验，并确定哪些女性将从PRP中获益最多。

4 结语和展望

PRP作为新兴的薄型子宫内膜患者子宫内膜制备的辅助方法，其影响子宫内膜再生的作用机制还未完全被揭示，现阶段的研究多与PRP内生长因子通过促进组织坏死消退和趋化，细胞再生、增殖和迁移，细胞外基质合成、重构，血管生成和上皮化等作用有关，但仍需要进一步研究PRP治疗的分子基础，以揭示其确切的机制，并为PRP对子宫内膜各病理生理的有益作用获得更确凿的证据，同时也降低其可能带来的潜在危险以确保PRP治疗的安全性。