携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌研究进展

余 艳，刘淑敏，杜 艳

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是一种重要的条件致病菌，在宿主免疫功能低下、菌群失调时，可引起呼吸道感染、泌尿生殖道感染、伤口感染、血流感染以及新生儿脑膜炎等[1]。碳青霉烯类药物具有良好的细胞通透性及高度的酶稳定性，是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBL）和头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌感染的主要药物，随着该类抗生素的广泛应用，全球各地相继出现碳青霉烯耐药阴沟肠杆菌（CR-ECL）播散流行。CHINET耐药监测网数据显示，2007年阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药率＜1.0%，2017年，对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率分别上升到6.9%、7.0%和8.2%，表明阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药趋势十分严峻[2]。

产碳青霉烯酶是阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制，其中以新德里金属β内酰胺酶-1（NDM-1）最受关注。产 NDM-1阴沟肠杆菌于 2007 年首次出现在印度，然后迅速播散到世界各地[3]。目前研究显示在CR-ECL中，NDM-1检出率最高，可能是CR-ECL的主要耐药机制[2,4-6]。产NDM-1阴沟肠杆菌常表现为多重耐药，这种“超级细菌”的播散流行，是对临床治疗的严峻挑战和对公共健康的重大威胁。

1 NDM-1概述

NDM-1共有270个氨基酸，分子量约28 kDa，氨基酸序列与其他已知的金属β内酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBL）相比，一致性不足33%[7]，其活性位点含有两个锌离子，NDM-1与底物之间的相互作用通过锌离子实现，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）能抑制其活性[8]。随着环境压力的变化，酶会发生突变以提高稳定性和适应性，从而导致功能发生变化。目前已鉴定出24种NDM-1突变亚型，命名NDM-1～NDM-24[9]。与NDM-1相比，其他突变亚型通常在氨基酸序列不同位置发生1～5个氨基酸替换，以M154L替换最常见，值得注意的是，所有突变均未发生在活性位点内。已经在阴沟肠杆菌中检测到的突变亚型有NDM-4、5、7、22[6,9-10]。研究表明仅在锌缺乏的条件下检测到部分突变亚型的耐药性增加，而且NDM-1正在进化以提高锌亲和力和锌活性，从而应对感染部位有限的锌浓度，表明锌缺乏可能是驱动NDM-1进化的关键因素[10]。产NDM-1菌株给临床治疗和公共健康带来极大威胁,原因主要有以下几点：①在这些细菌中检测到的大多数携带blaNDM-1基因的质粒是可转移的并且能够进行广泛重组，表明其水平传播的能力较强；②缺乏针对NDM-1的常规标准化表型检测方法；③无症状携带者的患病率可能很高；④缺乏有效的抗生素来治疗多重耐药的产NDM-1细菌，最终导致感染患者出现高死亡率[8-9,11]。

2 流行现状

2.1 国外流行现状

NDM-1于2008年在印度1株肺炎克雷伯菌中首次被报道，Castanheira等[3]通过回顾性调查证实早在2007年印度就已经出现了产NDM-1阴沟肠杆菌，并且很多产NDM-1菌株都来自社区获得性感染患者，表明blaNDM-1基因可能在环境中广泛存在，但目前对其在社区传播机制仍不清楚。2009年，Kumarasamy等[12]研究表明产NDM-1菌株在巴基斯坦、孟加拉国和英国广泛存在，其中一半以上的感染患者至少在一年内有印度医疗旅行史，推测产NDM-1菌株的传播与印度旅行史密切相关。2013年，土耳其、尼泊尔、墨西哥、新加坡、英国等多国报道了此类细菌的医院感染暴发，但具体流行起源尚不清楚[13-15]。美国退伍军人健康管理局的一项研究显示，在2014—2015年CR-ECL菌株的检出率出现明显增高[16]。抗菌药物耐药性趋势监测(SMART)结果显示，全球55个国家/地区103 960株肠杆菌科细菌中，NDM-1在CR-ECL中的检出率占比达到了36.36%，是最常见的碳青霉烯酶[17]。另一项跨国研究表明在产MBL菌株中，NDM-1所占比例最高达到了44.2%，MBL阳性菌株中阴沟肠杆菌排名第二，仅次于肺炎克雷伯菌，表明产NDM-1阴沟肠杆菌分布广、检出率高[18]。目前多项研究显示产NDM-1阴沟肠杆菌的传播可能与食物、水、空气污染有关，这可能是导致该菌在全球迅速传播的原因之一[8-9]。

2.2 国内流行现状

在中国，重庆医科大学于2012年首次分离出产NDM-1阴沟肠杆菌[19]，此后多次报道CR-ECL在碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）中分布最广、耐药率最高，NDM-1是当地CR-ECL中最常见的碳青霉烯酶，占比达61%，出现产NDM-1阴沟肠杆菌暴发流行[20-21]。2015年，河南报道了多所医院分离的CR-ECL菌株中NDM-1检出率高达72%[4]，类似的报道还出现在宁夏、云南、大连和青岛等地[22-23]。除了这些散发报道，Jin等[5]收集了中国11个城市临床分离的CR-ECL菌株，其中90%菌株产碳青霉烯酶，NDM-1占68%，并发生了深圳、东莞的小规模暴发流行。同时，中国一项大规模研究显示在CR-ECL中检测到的NDM-1从2013年25%增加到2016年的53%，占碳青霉烯酶的主要地位，并且产NDM-1阴沟肠杆菌已经在全国各地广泛播散流行，以华中、华南、华东以及西南地区为主[6]，这与王盛书[24]的报道一致。

综上所述，产NDM-1阴沟肠杆菌已经在全球各地播散流行，形成总体散发，局部高流行的趋势，并且产NDM-1是CR-ECL的主要耐药机制。值得注意的是，由于产NDM-1细菌耐药性强、感染者临床症状不一、各实验室检测能力不同以及全球广泛传播等因素再加上目前大部分研究是通过回顾性筛查留存标本获得阳性菌株，也有少部分通过个案报道或暴发疫情检出阳性菌，本文所涉及的可能只是产NDM-1阴沟肠杆菌实际流行情况的冰山一角，其实际分布范围可能更广，引起的公共卫生问题可能更加复杂。

3 耐药现状与传播机制

3.1 耐药现状

产NDM-1阴沟肠杆菌通常表现为多重耐药或泛耐药，其耐药机制十分复杂。由于染色体编码的AmpC酶，阴沟肠杆菌对氨苄西林，阿莫西林-克拉维酸，头霉素以及第一、第二代头孢菌素具有内在抗性。NDM-1不能水解氨曲南，但产NDM-1阴沟肠杆菌常携带ESBL耐药基因，会使菌株对氨曲南也耐药，再加上氨基糖苷类、喹诺酮类等多种耐药基因的合并表达，细菌膜孔蛋白缺失以及外排泵高表达等多种耐药机制并存，使其成为一种很难治疗的超级细菌[2,5-6,21]。研究表明部分菌株能同时携带两种或两种以上碳青霉烯酶基因，比如共表达blaNDM-1和blaKPC-2，blaNDM-1和blaIMP-1等，两种基因共存时要比blaNDM-1基因单独存在时耐药性更强[2,25]。多黏菌素和替加环素是目前治疗此类细菌感染的主流选择，大部分菌株对其敏感率较高，但随着该类抗菌药物的大量应用，多黏菌素耐药基因（mcr）的出现使耐药形势更加严峻，目前已经报道了同时携带blaNDM-1和mcr-1、blaNDM-1和mcr-4的阴沟肠杆菌[26]。同时也出现了对替加环素耐药的菌株[27]，这些耐药菌株的出现可能使得临床治疗陷入无药可用的境地，随之而来更大的挑战就是如何控制耐药菌的传播。

3.2 耐药传播机制

耐药菌不仅可以通过医疗器械、密切接触等途径在患者之间进行传播，也可以通过一些移动遗传元件（如质粒、转座子、整合子等）进行耐药基因的水平转移，以及blaNDM-1基因的遗传特征、携带blaNDM-1基因菌株的克隆背景等都可能导致耐药性的广泛播散。

3.2.1 质粒（plasmid） 这是独立于细菌染色体外能自我复制的环状DNA分子，可携带耐药基因加速细菌耐药性的传播。阴沟肠杆菌携带的blaNDM-1基因大多位于质粒上，其中以 Inc X3、Inc FII 、IncA /C2、IncFIA等几种类型质粒最常见，blaNDM-1基因通过各种不同类型质粒进行水平转移传播，并且某些型别的质粒能在多种细菌中定植生存，从而大大加快了耐药基因在同一菌种内和不同菌种间传播的速度[9,21]。

3.2.2 转座子（transposon, Tn） Tn是基因组中可以从一个位点直接移动到另一个位点的一段DNA序列。中国第一株携带blaNDM-1基因鲍曼不动杆菌有完整的Tn125复合转座子。贾晓炯[21]研究表明阴沟肠杆菌中blaNDM-1基因存在一段高度保守的序列，这部分序列不仅与中国分离的不动杆菌Tn125复合转座子序列相似，也与澳大利亚分离的携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌的序列非常相似[28]，表明这部分序列可能是导致blaNDM-1基因在不同菌种和地区间迅速传播的原因之一。

3.2.3 整合子（integron） 它是一种运动性分子，可以捕获外源性基因来增强细菌适应环境的能力。一直以来，整合子被认为是介导抗生素耐药性扩散、毒力以及致病性产生的重要移动元件，但目前没有研究表明整合子与blaNDM-1基因传播之间存在确切关系[29]。

3.2.4 遗传特征blaNDM-1基因的周围环境对耐药性传播非常重要，尽管blaNDM-1的确切来源尚不确定，但blaNDM-1的遗传背景具有两个共同特征，其上游都有插入序列ISAba125元件或片段，博来霉素抗性基因bleMBL则始终位于下游[9]，提示blaNDM-1基因周围高度保守的序列可能与其在不同菌种、地区间广泛传播有关。

3.2.5 克隆播散 目前对阴沟肠杆菌的克隆传播知之甚少，研究显示携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌呈遗传、克隆多样性，携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌的广泛传播不仅仅局限于某一种或数种特殊的克隆型别、ST 分型，不同国家和地区间的差异较大[2,4-6,13-15]。因此，与肺炎克雷伯菌ST258、ST11与blaKPC-2广泛传播之间的紧密关联不同，阴沟肠杆菌的ST类型与blaNDM-1的高流行率、广泛地理分布关系不大[2,9]。

4 致病机制与毒力

除了耐药，毒力也是细菌的重要致病因素,在感染中发挥重要作用。细菌感染宿主需要经历多个过程，首先是菌毛黏附系统吸附宿主细胞并发生定植[30]。细菌进入宿主细胞后分泌多种毒力因子以逃避免疫应答，阴沟肠杆菌的生物膜具有外周屏障、抵抗药物的作用，使其能够成功避免被清除，导致持续性、反复性感染，是其重要毒力因子[31]。细菌定植后铁摄取系统可以帮助细菌吸收铁，从而增强细菌侵袭性感染的能力[32]；体外细胞试验表明阴沟肠杆菌的三型分泌系统能破坏吞噬细胞和上皮细胞，与细菌感染宿主后导致组织破坏、细菌扩散，引起全身性感染密切相关；研究显示AcrAB-TolC外排系统不仅参与阴沟肠杆菌的耐药性，还与细菌的适应性和毒力有关[33]。在感染过程中，阴沟肠杆菌能产生多种毒素介导细菌的致病性，如肠毒素、成孔细胞毒素、白细胞毒性细胞毒素、α溶血素、甘露糖敏感的血凝素等[34-36]，其致病机制复杂，涉及多种毒力因子，在疾病发展中的作用机制目前仍不清楚。

通常情况下，细菌在获得耐药基因后，由于适应性代价的原因，会导致毒力下降。但也有学者认为NDM-1主要与细菌耐药性有关，不会影响毒力及致病性[37]。Brust等[31]对产NDM-1阴沟肠杆菌复合株进行毒力相关研究，结果表明在霍氏肠杆菌不同亚群中，blaNDM-1基因的缺失会影响生物膜的产生能力，但对大蜡螟幼虫的毒力没有统计学差异。赵金秋[38]通过体外生长能力和体内毒力试验证实blaNDM-1基因会使阴沟肠杆菌的繁殖能力及毒力增强。尧静[39]通过构建blaNDM-1基因敲除株与原始菌株进行比较，结果表明携带blaNDM-1基因会使阴沟肠杆菌体外生长能力增强，但对生长趋势与生长速度无影响。

综上所述，阴沟肠杆菌本身具有多种复杂的毒力因素，blaNDM-1基因的获得可能会对阴沟肠杆菌的致病性和毒力产生一定影响，但目前相关研究较少，还需要大量研究进一步明确。

5 结语

尽管各卫生保健机构已经作出了不懈努力，但携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌仍在全球范围内广泛传播，此类细菌易于播散和多重耐药的特性给公共健康带来了极大威胁，对其进行流行病学调查，分析其耐药机制、传播途径及致病机制，可为临床治疗与药物研发提供帮助。除积极开发抗菌剂外，医疗机构仍然需要加强耐药监测，严格控制医院感染，避免携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌的暴发流行。