质粒介导的替加环素耐药机制的研究进展

2021-03-28王知任李荷楠

中国感染与化疗杂志 2021年2期

王知任，李荷楠

1 概述

替加环素（tigecycline）是四环素类衍生的新型甘氨酰环素类抗菌药物，其在米诺环素的中心构架上增加了9-叔丁基-甘氨酰胺基侧链修饰结构[1]。替加环素进入细菌后可逆地结合于核糖体30S亚单位中的16S rRNA，阻断tRNA进入A位点从而抑制蛋白质转录翻译过程。通过结构研究发现，替加环素与核糖体30S亚基结合的同时，也与核糖体亚基H34残基相互作用，所以两者的结合比其他四环素类药物更牢固，抑制细菌蛋白合成的能力是四环素的20倍[2]。替加环素对除变形杆菌属和假单胞菌属外大多数革兰阳性和革兰阴性菌都有较强的抗菌活性，包括肠杆菌科、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌属、肺炎链球菌等[3]。由于其9位上的大取代基形成了空间位阻，替加环素不受大多数抗菌药物耐药机制影响，同时还克服了四环素的耐药机制，如编码核糖体保护蛋白的tet(O)、编码外排泵的tet(K)和tet(A)等[4]。由于替加环素广泛的体外抗菌活性，它和黏菌素被视作碳青霉烯类多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”，然而近年来随着其应用愈加广泛，耐药性的产生不可避免，替加环素耐药机制的研究也呈趋势性发展。

在已报道的替加环素耐药机制中，细菌外排泵系统起主要作用。RND型外排系统（resistancenodulation-division efflux systems）中特征性外排泵AdeABC、AdeFGH和AdeIJK表达活性过度增加，与双组份调控系统adeR和adeS的缺失和突变均可导致替加环素耐药[5]。此外，替加环素敏感性降低的原因还有修饰酶Tet(X)灭活替加环素、plsC基因突变改变细胞膜渗透性、rpsJ基因突变导致替加环素与核糖体之间亲和力下降等[6]。近期，有研究报道替加环素的耐药性可以由携带耐药基因的质粒通过接合的方式在细菌中传播[7]，进而可能引起医院内部耐药菌的暴发。耐药质粒可以在不同种类的细菌之间介导耐药的水平转移，其取决于宿主范围的宽窄、接合特性和效率。可转移质粒是传播耐药基因的理想载体，因为它们可以携带并表达多种耐药基因，并且经常携带能够促进其向另一细菌转移的基因。在质粒内，耐药基因通常由转座子携带，转座子可以在质粒之间转移耐药基因或将耐药基因于染色体中运进或移出[8]。位于质粒上的耐药基因、毒力基因或黏附因子为宿主提供了优势性状，使质粒得以进化为细菌基因组的组成部分[9]，质粒与整合子和转座子等遗传元件一起利用多种机制参与了这些性状的传播，从而消除了不同种类细菌之间的屏障[10]。质粒介导的耐药性的产生和传播目前已经成为耐药菌感染和暴发的重要原因之一，本文对近期质粒介导的替加环素耐药机制的研究进展进行综述，已经报道的质粒介导的替加环素耐药机制涉及的基因包括tet(A)、tet(X)、tet(M)和tet(L)。

2 编码四环素外排泵的tet(A)基因

tet(A)基因编码属于MFS家族的蛋白外排泵，通常定位于转座子Tn1721上，并在质粒和染色体上均可被检测到。Tn1721与接合质粒相关，所以tet(A)基因将有助于对四环素类抗生素耐药性的传播[11]。普遍认为由于替加环素可以抑制蛋白质的合成，tet(A)基因随着质粒接合进入细菌内就无法进行转录和翻译，因此不会引起细菌对替加环素的耐药。但是多项研究发现，tet(A)基因在肺炎克雷伯菌、肠炎沙门菌和鲍曼不动杆菌等革兰阴性菌中能升高替加环素最低抑菌浓度（MIC）。

通过持续监测1例接受替加环素治疗的癌症患者的肺炎克雷伯菌分离株，发现在治疗的早期阶段分离株对替加环素敏感，治疗13 d后分离出了与早期克隆一致的耐药菌株，通过全基因组测序和生物信息学分析发现耐药株存在tet(A)基因的点突变导致氨基酸改变[12]。耐药菌株与标准菌株ATCC 25922接合成功，接合子的替加环素MIC从0.125 mg/L增加至8 mg/L，增加了64倍，说明tet(A)基因突变可以引起替加环素MIC升高，并且这种耐药性还具有传播能力。后续通过DNA印迹杂交和PCR杂交验证了突变的tet(A)基因可以通过可转移质粒介导。这说明在替加环素的选择性压力下，可能发生tet(A)突变并导致治疗失败。

在食品和临床分离的肠炎沙门菌株中，检测到多个tet(A)基因移码突变的突变体[13]。DNA印迹杂交确定突变的tet(A)基因位于质粒，消除质粒后的菌株替加环素MIC均低于野生型分离株，说明tet(A)突变基因降低了菌株对替加环素的敏感性。在未对整个片段进行测序的情况下，用限制酶BsaWI消化tet(A)的PCR扩增产物来确定tet(A)是否携带突变，发现所有携带tet(A)的扩增产物均被切割，说明突变存在于相应的结构域间环路区域序列中，于是猜测替加环素耐药的增加可能是由于Tet(A)蛋白结构域间环C3区内的多个移码突变影响了替加环素的底物特异性[13-14]。研究还发现在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气单胞菌和黏质沙雷菌等细菌中均检测到与质粒和转座子等可移动遗传元件有关的突变的tet(A)基因，并且在不同国家的食品、临床标本、环境和人类菌群中均有发现[13]。

除了tet(A)基因的突变外，有研究发现RND型外排泵转运子AdeABC和AdeIJK可以与tet(A)基因协同作用使鲍曼不动杆菌获得替加环素耐药性[15]。敲除adeAB（ΔadeAB）的鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性明显增强，adeIJ的敲除（ΔadeIJ）也小幅增强对替加环素敏感性，表明adeAB是参与替加环素外排的主要RND外排泵。adeFG敲除的菌株在替加环素存在的情况下显示出与野生型相似的易感性表型，可能是由于adeG的转录水平较低。该研究构建了tet(A)表达质粒，以敲除不同RND基因的鲍曼不动杆菌标准菌株为宿主进行转化后检测替加环素MIC，发现所有菌株对替加环素的敏感性降低，包括替加环素敏感的ΔadeAB和ΔadeIJ菌株，证实了Tet(A)在替加环素外排活性中的重要作用。对暴露于替加环素时tet(A)基因表达进行RT-PCR，结果显示tet(A)表达量在有替加环素存在的情况下显著增加，说明替加环素耐药性的主要决定因素是tet(A)，RND型转运子AdeABC和AdeIJK在外排中起协同和/或叠加作用。Tet(A)与RND型转运蛋白协同作用的转运机制对于深入了解外排泵系统介导的替加环素耐药机制具有重要提示意义。

3 编码替加环素灭活酶的tet(X)基因家族

Tet(X)蛋白是黄素依赖性单加氧酶，可以修饰四环素和米诺环素，需要黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、镁离子和氧才能发挥活性[16]。在NADPH存在时Tet(X)可以修饰替加环素，表明替加环素同样是Tet(X)的底物，进一步利用液相色谱质谱数据分析发现其可在替加环素的碳11a处进行羟基化。研究还通过羟基化前后的替加环素MIC和阻断蛋白合成能力的定量比对，发现羟基化后的替加环素MIC升高同时抑制蛋白质翻译的能力更弱。虽然目前已经发现的tet(X)基因有tet(X1)～tet(X6)，但是根据命名中心的新标准，所有tet(X)变异体基因都只能称为tet(X)，为了描述方便本文中仍沿用旧称，目前仅有tet(X3)、tet(X4)和tet(X5)在质粒上有报道。

一项基于全基因组测序的研究从猪来源的鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌的替加环素耐药分离株中分别发现了tet(X3)、tet(X4)基因，两者均位于质粒上[17]。tet(X3)和tet(X4)的DH5α转化子的替加环素MIC是原来的64倍和128倍，携带tet(X3)的质粒也成功接合到一株携带blaOXA-23基因的鲍曼不动杆菌分离株中，替加环素的MIC升高到原来的128倍。小鼠感染模型证实tet(X3)和tet(X4)能够在体内介导替加环素耐药，并可能导致临床治疗失败。经过同源建模和色谱质谱分析证实了Tet(X3)和Tet(X4)通过对替加环素进行羟基化破坏胞内的药物。为了研究二者的遗传环境，实验还进行了三代测序和生物信息学分析，发现二者在各自的质粒上两侧都与插入序列ISVsa3相邻从而形成环状ISVsa3-tet(X3/4)中间体，tet(X3)和tet(X4)基因通过ISVsa3介导的转座在菌株之间传播。ISVsa3元件的普遍存在以及环状ISVsa3-tet(X)中间体的形成和转座使tet(X)变体基因在不同质粒间有潜在易位和整合到染色体上的可能性。动物粪便分离细菌中tet(X3)和tet(X4)的高检出率很可能是由于饲养中大量四环素的选择性压力造成的，推测tet(X)变异体正在成为最重要的替加环素耐药的决定因素。此外还进行了数据库挖掘和回顾性筛选分析，证实tet(X3)和tet(X4)在临床细菌中广泛存在，并会导致其对替加环素的耐药，所以需要加强临床替加环素耐药病原体中tet(X)变异体的监测。

还有研究在鲍曼不动杆菌临床分离株中检测到一种新的质粒介导的高水平替加环素耐药tet(X)基因变异体tet(X5)，其与tet(X3)和tet(X4)结合位点相似，对四环素的亲和力也相近[18]。tet(X5)重组载体转化子的替加环素MIC增加4～32倍。可能是由于质粒中缺乏接合元件，接合实验未能成功，但是菌株能够成功转化也表明该质粒可以在不动杆菌属中复制。利用tet(X)与米诺环素的复合体为模板进行同源建模，并将该模型叠加到Tet(X2)的X射线结构上，结果显示Tet(X5)的四环素结合位点与Tet(X2)的基本相同，这与Tet(X3)和Tet(X4)得到的结果相同，说明这组蛋白质之间可能具有高度序列同一性。为了探究其遗传环境，实验通过单分子实时测序得到了tet(X5)质粒结构，发现tet(X5)中心区域的两侧同样有两个ISVsa3拷贝形成了环状中间体，结合之前的研究结果推测其也有通过ISVsa3元件在菌株之间进行转座的可能，表明插入序列ISVsa3可能在所有检测到的tet(X)变异体的传播中起重要作用。可以推测，在质粒上的耐药基因两侧若有相同插入序列存在则可能形成环状中间体并通过转座在细菌之间进行耐药的传播。

此外，有研究发现在养鸡场的家禽样本和土壤样本中替加环素耐药的不动杆菌中含有共携带新型tet(X)和碳青霉烯耐药基因blaNDM-1的质粒，这些不动杆菌包括印度不动杆菌(A. indicus)、逊德勒不动杆菌(A. schindleri)、洛菲不动杆菌(A.lwoffii)和一种未知的不动杆菌[19]。通过全基因组测序发现了18个tet(X)和blaNDM-1共携带的分离株，其中15个携带的是新型tet(X)基因，15个中有6个菌株的新型tet(X)和blaNDM-1共定位于同一质粒。由于共携带tet(X)和blaNDM-1的质粒未能成功接合进入受体菌，于是进行了转化试验，成功验证了质粒介导的替加环素耐药性。通过单分子实时测序获得了完整的共携带新型tet(X)和blaNDM-1的质粒序列，发现6个质粒含有相似的两个多药耐药区和质粒骨架结构，包括编码质粒复制、维持和稳定的基因，并且其中5个质粒与第6个质粒pCMG3-2-1在核酸序列上有较高一致性，推测是在其基础上通过序列插入、置换、删除和转位形成的。结果还发现tet(X)基因的下游都存在插入序列ISCR2，blaNDM-1均位于Tn125转座子上，这种基因环境被认为与tet(X)和blaNDM-1的可移动性有关。尽管未能证明这类质粒的接合能力，也未能发现相应的质粒转移操纵子，但是在不同的物种、来源和地理区域中均发现高度相似的质粒，暗示该质粒具有可水平转移性。研究还发现除了家禽外其他鸟类物种也含有共携带质粒，水禽样本中共携带分离株的高检出率表明这些细菌可能通过被污染的水系统传播。令人担忧的是，碳青霉烯类和替加环素耐药基因的结合将同时使两类最重要的抗菌药物失去活性，考虑到动物、环境和人类之间的密切关系，应该密切监测这些菌株和质粒在人类社会中的进一步传播。

4 编码MSF泵的tet(L)和编码核糖体保护蛋白tet(M)

目前，在革兰阳性菌中也发现了两个四环素类抗菌药物的耐药决定簇——编码MFS超家族外排泵的tet(L)和编码核糖体保护蛋白的tet(M)[20]。研究将7株替加环素MIC在0.5～12 mg/L的屎肠球菌临床分离株在非选择性平板上培养115 d，以检测其耐药稳定性，发现7株中有2株MIC维持稳定、3株略有降低、还有2株完全丧失耐药，说明耐药性并不稳定。进而利用含高浓度替加环素的琼脂平板培养菌株，发现其中1株耐药丢失株的原分离株在培养4周后MIC升高至64 mg/L，成为耐药增强株。将这一分离株的原始株、耐药丢失株和耐药增强株进行全基因组测序和单分子实时测序，并经过S1-PFGE验证后发现其原始分离株和耐药增强株含有携带tet(M)和tet(L)基因的质粒，而耐药性丢失株则丢失了该质粒，说明该屎肠球菌的替加环素耐药由质粒介导，且可以丢失。Tet(M)是核糖体保护蛋白，阻碍四环素与23S rRNA结合；Tet(L)是MFS外排泵家族的一员，可以外排四环素却对替加环素无效，但是在耐药增强株中发现成熟Tet(L)蛋白的假定底物结合位点出现了氨基酸取代，推测该突变在替加环素耐药中发挥了作用。通过电转将tet(M)、tet(L)和tet(L)突变体的表达载体引入革兰阳性菌单核细胞增生李斯特菌中表达，结果显示天然Tet(L)对替加环素MIC的影响很小，突变的Tet(L)外排泵和核糖体保护蛋白Tet(M)均使替加环素MIC值升高数倍，这也就表明即使在非天然宿主中Tet(L)和Tet(M)也可介导替加环素的耐药。此研究并没有直接验证其可转移性，所以质粒是否存在转座子或插入序列而具有传播耐药的能力尚未得知。另外逆转录实时定量PCR也验证了耐药增强株中tet(M)和tet(L)均过表达，tet(M)和tet(L)拷贝数和/或表达的增加使肠球菌的替加环素耐药增加。由此可见对于革兰阳性菌的替加环素耐药监测也不可忽视，质粒耐药基因的机制仍需进一步研究。