厄贝沙坦对自发性高血压大鼠的降压作用及肾脏RAS 基因表达分析

陈思思 薛晓敏 李 毓 朱冰儿 陈力豪 吴 悦 吴人照

1.浙江省中医药研究院基础实验研究所，浙江杭州 310007；2.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州 310053；3.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江杭州 310053

全球高血压患病率在逐年增加，专家预计到2025 年全球高血压患者将上升达15 亿人[1]。最新研究显示中国成年人高血压患病率已达27.9%[2]，是我国心脑血管疾病的首要危险因素。高血压可导致如心肌梗死和脑卒中等致命性心脑血管疾病[3]。据《中国心血管病报告》统计报道[4]，2016 年我国因心血管病死亡例数占比达40%以上，死亡率高于肿瘤及其他疾病，严重危害国民健康。针对高血压治疗的药物一直是临床关注的重点，目前血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）、血管紧张素转化酶抑制剂 （ACEI）、β-受体阻滞剂被JNC8等指南推荐为高血压的首选用药[5]。ARB 类药物主要通过阻断血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）与受体结合达到抗高血压的作用，近年来其在临床抗高血压治疗中应用日益广泛[6]。厄贝沙坦属于ARB 类，在轻中度高血压患者中，因其降压效果优于氯沙坦和缬沙坦[7]，临床应用最广泛。目前尚未了解厄贝沙坦对SHR 大鼠降压相关的基因表达情况的影响，因此，本实验以SHR 大鼠为研究对象，观察厄贝沙坦对SHR 大鼠的血压作用及ACE2、血管紧张素Ⅱ受体-1（AT1R）和AT2R mRNA 表达的情况，旨在为深入了解高血压降压机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

34 周以上（老龄）SHR 大鼠，Wistar 大鼠，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证：SYXK（浙）2019-0010。实验过程遵循了单位和国家有关实验动物保护与使用的准则，并经本单位实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要仪器及试剂

日本BP-98A 型无创尾动脉血压测量仪；美国Thermofisher Nano Drop 2000 核酸蛋白定量仪；美国ABI Step One Plus 荧光定量PCR 仪；厄贝沙坦片购自赛诺菲制药有限公司；Trizol 试剂、逆转录试剂盒（047A）、SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司。上海生工生物工程有限公司设计并合成引物。

1.3 实验分组

大鼠适应性饲养1 周后测量血压，将SHR 大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组，每组6 只，另设6 只Wistar 大鼠为正常对照组。厄贝沙坦临床上人的常用剂量为150 mg/d，按正常人体重60 kg 计算，剂量为2.5 mg/（kg·d），以人用剂量的6 倍作为大鼠的给药剂量，即15 mg/（kg·d）。厄贝沙坦组每天灌胃15 mg/kg厄贝沙坦，模型组和正常对照组灌胃等量饮用水，给药8 周，每周测量1 次给药3 h 及24 h 的血压，观察收缩压（SBP）、舒张压（DBP）的波动变化。RT-qPCR检测肾组织中ACE2、AT1R、AT2R 的表达情况。

1.4 测量血压

将大鼠置恒温水浴锅上预热，随环境温度的变化对加热时间进行调整，使大鼠尾部血流量充盈便于血压的测量。连通BP-98A 型无创尾动脉血压测量仪，并通过配套软件读取数据。每只大鼠在清醒安静状态下测量6～10 次血压，其均值为测量所得值。

1.5 相关基因的表达情况

取肾脏组织100 mg，彻底匀浆后用Trizol 试剂提取总RNA 并测定浓度。用逆转录试剂盒获取cDNA，再采用SYBR Green 实时荧光定量PCR 试剂盒检测肾脏ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的表达量。其中PCR反应体系为20 μL，包括SYBG 10 μL，H2O 6 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，模板DNA 2 μL。反应条件为：95℃30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，共40 个循环；95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s 熔解曲线。基因的引物序列具体见表1。

1.6 统计学方法

运用SPSS 21.0 统计软件对所得数据进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用重复测量方差分析，进一步两两比较，采用LSD-t 检验。计数资料以例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 厄贝沙坦不同给药时间点对SHR 大鼠SBP 的影响

厄贝沙坦组与模型组大鼠SBP 在给药后3 h 和24 h 中，时间及交互作用比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），而组间比较，差异有高度统计学意义（F=2023.083、864.881，P ＜0.01）。厄贝沙坦组SBP 首次给药，第2、4、6、8 周给药后3 h 及24 h 低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。厄贝沙坦组SBP 在给药后3 h 均有显著下降，在给药后24 h 有所回升，但仍低于治疗前SBP。见表2。

表1 各基因引物序列

2.2 厄贝沙坦不同给药时间点对SHR 大鼠DBP 的影响

厄贝沙坦组与模型组DBP 在给药后3 h 和24 h时，时间及交互作用比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），而组间比较，差异有高度统计学意义（F=691.944、449.783，P ＜0.01）。厄贝沙坦组DBP 首次给药后3 h低于模型组，第2、4、6、8 周给药后3 h 及24 h 低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表3。

2.3 厄贝沙坦对SHR 大鼠肾脏中各基因相对表达量的影响

与模型组比较，厄贝沙坦组ACE2 mRNA 相对表达量降低，AT2R mRNA 相对表达量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表4。

表2 厄贝沙坦片不同给药时间点对SHR 大鼠SBP 的影响（mmHg，）

表2 厄贝沙坦片不同给药时间点对SHR 大鼠SBP 的影响（mmHg，）

注：与模型组同期比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。SBP：收缩压。1 mmHg=0.133 kPa

表3 厄贝沙坦片不同给药时间点对SHR 大鼠DBP 的影响（mmHg，）

表3 厄贝沙坦片不同给药时间点对SHR 大鼠DBP 的影响（mmHg，）

注：与模型组同期比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。DBP：舒张压。1 mmHg=0.133 kPa

表4 肾脏中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相对表达量（）

表4 肾脏中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相对表达量（）

注：与模型组同期比较，*P ＜0.05。ACE2：血管紧张素转化酶2；AT1R：血管紧张素Ⅱ受体-1；AT2R：血管紧张素Ⅱ受体-2

3 讨论

在降压药物研发过程中，谷峰比是其疗效评价的一个重要指标。谷峰比越高提示在24 h 内药物降压作用越稳定，有助于减少对靶器官的损伤[8-9]。前期预实验研究发现给药3 h 的谷峰比最高，其降压疗效最稳定，故本研究选择在给药3 h 和24 h 这两个时间段测量血压，以评价厄贝沙坦的最大降压疗效。

高血压对机体的心脑肾等器官具有严重损害，其发生、发展过程中涉及多个系统的参与。研究显示[10]，肾素-血管紧张素系统（RAS）是参与血压调节的重要系统。Ang Ⅱ是RAS 的主要活性物质，主要发挥收缩血管等作用[11]，主要作用于AT1R，小部分作用于AT2R[12]，其中AT1R 具有强烈的血管收缩作用，而AT2R介导的生物学作用与AT1R 相反，主要为利钠作用，降低Na+在近曲小管中重吸收，保持Na+负平衡，进一步降低血压[13]。厄贝沙坦通过拮抗AT1R 抑制Ang Ⅱ介导的血管收缩和醛固酮的释放，从而产生降压作用。AT1R 和AT2R 在血压调节中存在功能性相互作用，AT1R 阻断后Ang Ⅱ增加导致其对立的AT2R 的刺激升高作用，本研究结果中AT1R 表达降低，而AT2R升高，与文献[14]报道结果一致。

近年来，ACE2 基因作为RAS 系统的新成员被广泛研究，在体内的主要作用是将Ang Ⅱ转化为Ang（1-7），后者在体内能引起血管扩张，产生降血压的作用从而维持机体正常的血压平衡[15-16]。ACE2 对最初高血压形成起重要作用，多数文献报道[17-22]沙坦类或其他药物可使高血压大鼠肾脏和心肌组织的ACE2 mRNA和蛋白表达增加，且多呈现出剂量依赖趋势。而本研究却发现厄贝沙坦治疗后ACE2 表达降低，推测可能与文献[23]所提出的通路有关，厄贝沙坦选择性与AT1R结合，此时循环中Ang Ⅱ反馈增加，Ang Ⅱ又可以通过激活信号分子ERK1/2 和p38 MAP 上调ACE 并下调ACE2 的表达。厄贝沙坦使机体内血压降到低点后，机体产生血压调节的保护作用，不再需要ACE2 协同来发挥降血压作用，从而厄贝沙坦组的ACE2 表达降低。由于本研究样本量偏小，而且只设置了一个给药浓度，后期可考虑多个给药剂量，深入研究厄贝沙坦的剂量不同是否对ACE2 表达有所差异。尽管目前ACE2 的信号通路已经很好地建立，但Ang Ⅱ诱导的ACE2 的信号传导机制仍然不太明确，后期需要进一步研究。