家畜布鲁氏菌病相关疫苗的研究进展

孙天浩，马忠臣，张 欢，程科建，陈创夫，2，王 震，2*，张 倩

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；2.西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，新疆石河子832000；3.新疆农垦科学院，新疆石河子832000）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病[1]。布鲁氏菌属于α-变形杆菌，是一种兼性胞内病原菌，能够感染哺乳动物和人类。反刍动物是易感动物，主要表现为公畜的睾丸炎和附睾炎、母畜的流产和不孕。布鲁氏菌病严重影响动物的生产性能和繁殖性能。人类布鲁氏菌病主要是通过直接接触布鲁氏菌感染的动物或食用未经消毒的动物源性食品或奶制品而感染，造成类似于流感症状的波浪热、脊柱炎、关节炎等非特异性症状[2]。布鲁氏菌病不仅导致经济损失、妨碍全球性贸易，而且严重威胁公共卫生安全。所以，控制、根除布鲁氏菌病已经成为当前经济和社会发展的重要任务，而疫苗接种是控制该病的主要手段。目前，布鲁氏菌疫苗主要分为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、突变株候选疫苗和异源表达疫苗等。文章主要介绍目前存在的布鲁氏菌相关疫苗的研究现状及其保护效果。

1 灭活疫苗

灭活疫苗可以为动物提供安全有效的保护，降低动物的免疫抑制，不污染牛奶和肉类，不引起孕畜的流产[3]。目前，布鲁氏菌灭活苗的开发取得一定的成果，主要有牛种布鲁氏菌45/20和羊种布鲁氏菌53H38灭活疫苗。

1.1 牛种布鲁氏菌45/20灭活疫苗

牛种布鲁氏菌45/20疫苗的菌种是1种粗糙型菌株，是由牛种布鲁氏菌45株在豚鼠体内连续传代培养20代所获得，故称之为布鲁氏菌45/20，将其灭活后制成的油包水型灭活疫苗，在20世纪20年代开始使用[4]。该疫苗免疫牛群后，可提供免疫保护作用，并可用于孕畜。由于布鲁氏菌45/20灭活疫苗为粗糙型菌株，动物免疫后不产生抗O-链多糖的抗体，因此不干扰常规血清学诊断。但是，因为原始的45/20菌株遗传稳定性差，在体内环境中会转化成S中间型[5]。而且该疫苗免疫动物后会出现局部反应，各批次间免疫效果差别较大。因此，此种疫苗未推向市场使用。

1.2 羊种布鲁氏菌53H38灭活疫苗

20世纪60年代，Glenchur[6]等将S型羊种布鲁氏菌菌株H38灭活后，加入矿物油佐剂乳化后接种绵羊，发现该疫苗能够抵抗布鲁氏菌的感染，并保护孕羊避免流产。但是，由该疫苗存在灭活过程中抗原表位易丢失，免疫剂量较大，干扰常规血清学诊断，接种部位容易引起局部反应，不能诱导细胞毒性T淋巴细胞反应等缺点，因此限制该疫苗的大面积推广。

2 减毒活疫苗

减毒活疫苗对于抵抗胞内病原体具有重要作用，弱毒疫苗可用于控制牛、羊和猪种布鲁氏菌病。目前，常用的减毒活疫苗包括牛种布鲁氏菌减毒活疫苗S19和RB51；羊种布鲁氏菌减毒疫苗Rev.1和M5-90；猪种布鲁氏菌活疫苗S2。

2.1 牛种布鲁氏菌S19疫苗

牛种布鲁氏菌活疫苗S19是1923年发现的天然减毒的光滑型布鲁氏菌的突变株。该菌株缺少一个由702 bp编码的赤藓醇代谢基因，从而表现出对赤藓醇的敏感性[7]。S19疫苗已在全球多个地区用于牛布鲁氏菌病的预防，目前仍然在印度和阿根廷被广泛使用。牛种布鲁氏菌S19疫苗可产生较高的免疫力，抵抗牛感染布鲁氏菌后引起的流产。使用S19疫苗免疫牛群后，约有65%～75%的牛能够受到完全保护，其余25%～35%的牛群虽然会受到感染，但并不引起流产症状[8]。研究表明，S19疫苗能够阻止70%～91%的牛群发生流产，但其保护效果取决于免疫剂量[9]。减少疫苗剂量的使用未影响抗体滴度的持久性，而且持续时间与全剂量免疫基本相同。因此，Erasmus等[10]建议，在流产布鲁氏菌流行的地区减少S19疫苗的使用剂量。然而，在怀孕期间免疫S19却可引起孕牛的流产，而且在孕期的后3个月使用该疫苗，其流产率明显高于其他孕期[11]。研究发现，怀孕母牛皮下注射S19疫苗可造成3.2%的流产率，静脉注射则可导致100%流产，即使降低其使用剂量（标准剂量的1/20到1/100）仍可观察到流产现象[12]。也有报道称，使用该疫苗后，奶牛的产奶量降低[5]，而且该疫苗通过受损皮肤和污染的灰尘引起人的感染[13]。

目前，S19疫苗被指定用于犊牛（4～12月龄）的免疫，犊牛接种S19疫苗也存在一定的副作用，如公牛或犊牛的睾丸炎和关节炎等[14]。Wyn-Jones等[15]研究发现，流产布鲁氏菌S19的抗原物质存在于免疫动物的膝关节、滑膜和淋巴结中，同时光滑型布鲁氏菌疫苗S19由于具有完整的O侧链抗原，因此产生的抗体不能使用标准的血清学方法区分自然感染和疫苗免疫。因此，目前对S19的改造主要集中在如何降低其毒力，同时保留其良好的免疫原性。最新研究显示，环1，2-葡聚糖合成酶基因突变株具有疫苗开发潜力的1株候选株，其不仅可产生不依赖于O抗原的免疫反应，也保留其对野生型流产布鲁氏菌2308的免疫保护效果[16]。但这些疫苗的研究还有待在动物身上进行验证试验。

2.2 牛种布鲁氏菌RB51疫苗

1996年，为解决S19疫苗血清学试验不能区分自然感染和菌苗免疫的缺点，Luis等[17]将牛种布鲁氏菌2308株在含有利福平和青霉素的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养，筛选出的1株具有利福平耐药性的粗糙型布鲁氏菌菌株RB51。临床使用表明，RB51疫苗免疫犊牛表现出比其他疫苗更优异的免疫保护效果；其接种犊牛（4～12月龄）后未表现出任何临床体征，也不会在注射部位引起局部反应。而且在接种2周后细菌即可在血液中被清除，不会从鼻腔分泌物、唾液、尿液中排出，其免疫保护作用通过细胞免疫介导，牛接种该疫苗后在不同布鲁氏菌感染环境中，1年内能保护全部动物避免流产。另外，RB51疫苗株的LPS缺少O-侧链，不会诱导机体产生抗O-侧链抗体，可通过传统的血清学检测，而且RB51的保护效果明显优于S19疫苗[18]。

RB51疫苗主要用于牛的免疫，也可用于绵羊和山羊，但其对怀孕绵羊的保护力较低，也不能提供足够的保护力以抵抗绵羊种布鲁氏菌的感染[19]。除用于家畜外，RB51疫苗也在野生动物如美洲野牛、驼鹿中使用。研究发现，与未免疫的野牛相比，接种RB51疫苗（1.2×1010～6.1×1010CFUs）后其流产率从62%降低至15%。但RB51疫苗的重复免疫并未增加其免疫保护效果[20]。另有研究表明，RB51对麋鹿具有致病性，可导致71%麋鹿流产[21]。而RB51疫苗的缺点主要表现为对人的感染以及对利福平的耐药作用[22]。由于利福平是人类治疗布鲁氏菌病最有效的抗生素[23]，也是妊娠患者、青少年、心内膜炎和神经性布鲁氏菌患者使用最为常见的抗生素。因此，该疫苗具有的利福平耐药作用对于此类人群感染该菌株后的治疗极为不利。

2.3 羊种布鲁氏菌Rev.1

羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗被认为是控制羊布鲁氏菌病的最好疫苗，目前已经通过世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）的认证[24]。这种疫苗是由光滑型羊种布鲁氏菌野毒株6056在含有链霉素的培养介质中筛选获得。因此，该菌株具有链霉素抗性。Rev.1疫苗通过皮下注射使用时可产生较高的抗体滴度，但不利于疫苗免疫和自然感染动物的区别。而通过结膜接种后，血清学应答反应较低，有利于免疫动物的区分。因此，Rev.1常采用结膜免疫途径用于小反刍动物布病的防控。Rev-1疫苗对山羊的保护力可持续4.5年，与未免疫组相比，其组织感染率从92%下降至16%。因此，Rev.1疫苗被多个国家用于布病的防控，如塔吉克斯坦于2004年使用Rev.1对13 006只小反刍动物进行免疫接种。5年后，与未免疫地区相比，布病阳性率下降80%[25]。20世纪末葡萄牙也利用Rev.1疫苗控制本地区的布鲁氏菌病，共免疫动物2.4万头，畜群的血清阳性率从8.4%下降至1.2%。同时，该疫苗还具有交叉保护的能力，可以抵抗流产布鲁氏菌的感染[26]。

Rev.1疫苗在绵羊或山羊布鲁氏菌病的防控中发挥重要作用，但也存在某些弊端。如通过皮下注射或结膜免疫的Rev-1均可从母羊阴道分泌物中分离到细菌，而且在泌乳山羊的奶液中检测到布鲁氏菌[27]，Rev-1疫苗仍然具有一定毒力。研究发现，Rev-1疫苗免疫绵羊1 d后即可进入血液中，并在血液中持续存在60 d以上，其菌血症的持续存在可能使其具有在动物间的传播能力[26]。此外，Rev-1也可感染人类，尤其是兽医工作者，而且其毒力比S19疫苗更强。

2.4 羊种布鲁氏菌M5-90疫苗

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗是我国哈尔滨兽医研究所对布鲁氏菌强毒株H28在鸡成纤维细胞上连续致弱90代后培育而成的减毒活疫苗。20世纪80年代，石宗舫等[28]对该疫苗在山羊上的免疫效果进行评估，发现该疫苗具有较好的免疫效果，免疫15个月后仍能抵抗布鲁氏菌野毒株的感染。该疫苗在免疫效果、抗体消长规律和效价等方面与S2弱毒苗相似，但该疫苗不能用于孕畜的免疫。鲁志平[29]使用M5-90疫苗免疫山羊后其流产率高达100%。程君生等[30]对M5-90的毒力进行比较发现，该菌株的毒力高于S2疫苗株和A19疫苗株，说明该疫苗仍具有一定的毒力，对人和动物具有潜在的致病性，而且常规血清学方法难以区分疫苗免疫和自然感染。

2.5 猪种布鲁氏菌活疫苗S2

猪种布鲁氏菌2号菌株（S2）是从流产母猪体内分离，经过连续传代获得的1种光滑型减毒株。自1958年开始，我国将S2疫苗添加到饮水中制成口服疫苗，可有效保护82.7%绵羊、82.1%山羊、75.0%母猪和71.4%奶牛免受感染。连续使用S2疫苗口服免疫猪群2年，可使血清学阳性从62.8%～75.0%降低至0～2.4%。小鼠试验表明，S2的毒力低于Rev-1和S19，但其仍具有潜在的致病性；S2疫苗与Rev-1和S19疫苗相比，其短期免疫力无显著差异，但其长期免疫力显著低于Rev-1和S19疫苗[31]。S2通过结膜免疫虽然可对绵羊提供一定的保护力，但明显不如Rev-1疫苗[32]，说明S2疫苗可能不适合结膜免疫途径。

3 布鲁氏菌亚单位疫苗

亚单位疫苗不会引起动物的感染和流产，因此对动物和人类是安全的。随着研究的深入，布鲁氏菌的保护性抗原逐渐被挖掘，并将具有免疫原性的布鲁氏菌表面分子和抗原成分制成亚单位疫苗。目前，通过小鼠模型对多个亚单位疫苗进行评价，包括嘧啶合成酶、Bp26、InfC、L7/L12、Omp16、Omp19、Omp25、Omp28、Omp31、P39、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶、DnaK、SurA和SodC等。Omp31是布鲁氏菌的外膜蛋白，对小鼠模型的感染具有保护作用[33]。非脂化的外膜蛋白Omp19作为亚单位疫苗可产生Th1细胞反应[34]。DNAK和SurA蛋白可诱导产生体液免疫和丰富的细胞毒性反应[35]，脂蛋白L7/L12可诱导Th1细胞因子的产生，产生有效的细胞免疫和体液免疫反应[36]。此外，其他纯化的重组抗原也可对布鲁氏菌病产生保护作用。研究发现，使用聚微粒包裹绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白制备的亚单位疫苗免疫公羊后，可产生与Rev.1类似的保护力[37]。利用流产布鲁氏菌可溶性抗原和亚甲基十八烷基二甲基溴化铵共同免疫公牛，可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应。野牛通过肌肉注射免疫Bp26和TFDNA疫苗后，抗体的产生和T细胞增殖能力显著增强[38]。最近，Leclerq等[39]发现，外膜蛋白（GBOMP）可有效提高小鼠对布鲁氏菌的抵抗能力。流产布鲁氏菌LPS、外膜蛋白及免疫佐剂的联合使用可诱导高效的免疫应答反应并抵抗布鲁氏菌的感染；布鲁氏菌外膜囊泡（GBMOMV）亚单位疫苗不仅是该类疫苗的重要组成成分，而且还具有纳米佐剂的作用，可产生较好的免疫保护作用。因此，亚单位疫苗具有较大的发展潜力，而且由于布鲁氏菌菌株间的基因同源性高达94%以上。所以，亚单位疫苗可为不同种的布鲁氏菌病提供保护作用[40]。

目前，虽然这类疫苗具有一定的保护效果，但其有效性仍低于现有弱毒苗RB51、S19或Rev.1等，而且其制造成本较高。因此，该类疫苗存在一定的局限性。此外，这些疫苗大多通过小鼠模型进行评价，在家畜中的有效性仍需经过大量试验进行验证。

4 布鲁氏菌DNA疫苗

DNA疫苗可诱导机体的体液免疫和细胞免疫反应（Th1和CTL），并保护机体免受多种病原体的入侵。对布鲁氏菌病DNA疫苗的研究显示，其可诱导强烈的Th1应答反应，对流产布鲁氏菌具有一定的抵抗作用[41]。目前，用于布鲁氏菌病DNA疫苗的靶基因主要有OMP31、L7、L12、BLS和SOD等，这些布鲁氏菌DNA疫苗可在一定程度上预防布鲁氏菌的感染[42]，而且其可诱导机体产生单一蛋白的免疫应答，从而有利于布鲁氏菌病的临床诊断。

多个布鲁氏菌抗原的联合表达也是提高该类疫苗免疫保护作用的重要手段之一。研究显示，同时表达L7、L12和OMP16的DNA疫苗能够刺激T淋巴细胞的增殖及γ干扰素的释放，攻毒保护力亦明显高于单抗原的DNA疫苗。同时表达L7、L12、BCSP31和SOD的DNA疫苗，其抵抗野毒感染的能力高于疫苗株RB51和S19[43]。多抗原串联表达与细胞因子如白介素的联合表达是提高该类疫苗免疫效果的另一个重要手段，其可以增强细胞毒性反应和延长免疫保护期。虽然该类疫苗具有安全性高等优点，但至今尚无有效的布鲁氏菌DNA疫苗问世。

5 布鲁氏菌基因突变株候选疫苗

由于现有布鲁氏菌弱毒苗普遍存在安全性低、残余部分毒力或干扰血清学诊断等缺点。因此，通过基因工程手段对现有弱毒苗的毒力基因或O抗原基因进行缺失突变已成为改造现有疫苗的主要方法。

5.1 流产布鲁氏菌突变株候选疫苗

流产种布鲁氏菌突变株候选疫苗的研发主要表现为毒力的降低，如构建的脂质A脂肪酸运输基因bacA突变株、亚铁螯合酶基因hemH突变株和Ⅳ型分泌系统virB突变株等候选疫苗其毒力均明显降低，但其保护效果仍有待于进一步研究[44]。磷酸甘油酸酯激酶pgK突变株候选疫苗在小鼠模型中具有同S19和RB51疫苗相同的保护力[45]。野生型布鲁氏菌葡萄糖磷酸变位酶pgm突变株和锌吸收系统znuA突变株候选疫苗具有S19同等的保护效果[46]。而且流产布鲁氏菌pgm缺失株候选疫苗产生的抗体不依赖于O侧链抗原，因此可用于与野毒布鲁氏菌的区分[47]。

5.2 羊种布鲁氏菌突变株候选疫苗

由于羊种布鲁氏菌疫苗Rev.1和M5-90均不能对野毒布鲁氏菌进行有效区分，因此对这类疫苗的改造主要集中于LPS的缺失，包括核心多糖和O链多糖。研究人员对wa突变株、per突变株和wbkF突变株候选疫苗的研究显示，在布鲁氏菌感染过程中其抵抗母羊流产的能力弱于Rev.1[48]。在另一项研究中，研制的6种羊种布鲁氏菌rpoB基因突变株候选疫苗均能够对小鼠腹腔接种布鲁氏菌野毒株的感染起保护作用，其中2株候选疫苗的保护作用类似于Rev.1，且均优于RB51疫苗，而且也不诱导O抗原抗体的产生；随后研究的14株羊种布鲁氏菌LPS基因突变株中的两株候选疫苗具有与Rev.1相同的保护力，但其接种剂量却比Rev.1高1 000倍[22]。最近研究发现，口服给药可能是布鲁氏菌减毒的另一个模式；羊种布鲁氏菌16MΔznuA疫苗候选株口服免疫后，对鼻内感染羊种布鲁氏菌强毒株16M的抵抗力优于RB51疫苗株[49]。

5.3 猪种布鲁氏菌突变株候选疫苗

对猪种布鲁氏菌突变株候选疫苗的研究主要体现为毒力基因的缺失，如猪种布鲁氏菌芳香族氨基酸生物合成基因aroC突变株、布鲁氏菌毒力因子bvfA突变株和一氧化氮还原酶norD基因突变株在小鼠模型评价中其毒力明显减弱。而猪种布鲁氏菌赤藓醇代谢基因eryC和双组份调控系统ntrC基因缺失株在小鼠体内毒力未发生明显下降[50]，说明这些突变株并未完全减毒。

6 异源表达的布鲁氏菌疫苗

使用活疫苗载体异源表达布鲁氏菌保护性抗原可为各种抗原提供有效表达途径[51]。目前，许多弱毒疫苗载体已被批准用于人类，并被证实是安全的。使用减毒沙门氏菌表达布鲁氏菌的L7/L12和嘧啶合成酶融合蛋白的重组活疫苗对抵抗野生型流产布鲁氏菌的能力明显优于重组蛋白[52]。然而，与布鲁氏菌活疫苗104M相比，沙门氏菌为基础的疫苗提供相对较低的保护力。在减毒的猪沙门氏菌中表达流产布鲁氏菌保护性抗原BCSP31并通过口服免疫小鼠和猪后，可诱导机体产生免疫反应，但其保护效果不如乳酸球菌中表达流产布鲁氏菌L7、L12所产生的IgA滴度高，并且在小鼠模型中的保护效果不如S19[53]。RB51作为一种活疫苗载体重组同源性抗原，以增强其免疫保护力，在RB51中过表达sodC和wboA，可抵抗野生型猪种布鲁氏菌1330的侵染[54]。一些病毒载体也被用于布鲁氏菌抗原的表达，L7、L12在牛痘病毒中的表达虽然可以诱导抗L7、L12抗体的产生，但免疫保护能力较低[55]。在有复制缺陷的塞姆利基森林病毒中表达流产布鲁氏菌转录起始因子IF3和sodC，虽然可抵抗野生型流产布鲁氏菌2308的感染，但与RB51疫苗相比其保护水平仍然很低[56]。

7 展望

理想的布鲁氏菌疫苗应具有安全无毒、免疫效果好，能够防止两性动物（公和母）的感染、防止孕畜流产、接种一次疫苗可长期预防、不污染牛奶和肉类等特点。尽管当前布鲁氏菌商品苗（主要为弱毒活疫苗）对控制和预防动物布鲁氏菌病是有效的，但仍需要对其安全性和毒力进行优化和改善。随着布鲁氏菌全基因组序列的完成，越来越多的功能基因被不断发现和研究，必将会有更多的靶基因可以用于疫苗的改造或利用，这也为开发具有应用前景的布鲁氏菌新型疫苗提供更广泛的空间。