干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展

张 帅,冯子岑，张云山

(天津市中心妇产科医院生殖医学中心，天津 300100)

近十年来，世界范围内不孕症发病率已由10%增加到15%[1]，其中由于各种原因导致的卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)女性患者占不孕人群总数的1%～3%[2]。目前大多POF患者由于缺乏健康配子而无法生育自身遗传学后代，仅有极少数患者依靠供卵及辅助生殖才能完成生育，而这又涉及伦理、社会传统观念等因素影响，因此限制了其在临床上的应用。最近越来越多研究显示[3-5]，在特定培养条件下可将小鼠多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)诱导分化为卵母细胞，并具有正常受精、卵裂能力，目前已经成功获得健康子代小鼠出生。无疑，这一研究成果将会为渴望生育自己遗传后代POF女性带来巨大希望。本文就近年来国外关于小鼠和人类干细胞向雌性生殖细胞(female germ cells,FGCs)分化的研究进展综述如下。

1 干细胞定义及来源分类

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据其分化潜能不同[6]，干细胞可分为全能干细胞(totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)、专能干细胞(multipotent stem cells)和单能干细胞(unipotent stem cells)。

1.1 全能干细胞 是指受精卵到桑椹胚时期的细胞，可分化成任何种类的细胞，并能发育成完整个体。

1.2 多能干细胞 是指可以分化为任何一种组织类型、但不能分化为生物个体的细胞，主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

1.3 专能干细胞 是指有能力在一个特定的谱系内分化成所有类型的细胞，在机体发育、组织修复和保护过程中起着重要作用，如成体干细胞、脐带血干细胞等。专能干细胞具有许多优点和用途，目前主要被用于治疗不同的疾病，如脊髓损伤、骨折、自身免疫性疾病等[6]。

1.4 单能干细胞 主要是指组织特异性前体细胞，在体内通常只能形成一种细胞类型，如造血干细胞、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)、卵巢干细胞(ovarian stem cells,OSCs)等。虽然目前关于卵巢上皮中是否存在OSCs仍存争议，但最近越来越多的报道，包括小鼠、绵羊、兔、狨猴及人类等研究结果均表明卵巢上皮中确实存在极少量的OSCs[7]。

2 生殖细胞的体内发生

哺乳动物生殖细胞，包括精子和卵子均来自于共同的配子前体细胞-PGCs。

小鼠PGCs最早发现于胚胎发育的第6.25日(E6.25)，位于胚胎外胚层远端，随后进行分化、迁移并于E10.5左右到达生殖嵴[8]。人类PGCs最早发现于妊娠第3周末，位于卵黄囊内胚层的背侧壁，第4周时开始迁移，并于5～6周时迁移至生殖嵴[5]。PGCs到达生殖嵴后，依据其周围体细胞不同的诱导信号而最终分化为精子或卵母细胞。总体来说，哺乳动物PGCs在向原始性腺迁移过程中经历了广泛的表观遗传重编程，包括全基因组DNA去甲基化、基因印记清除、雌性失活X染色体的重塑及重新激活等[9]。

3 各种干细胞向FGCs诱导分化

3.1 ESCs向FGCs诱导分化 ESCs是一种来源于囊胚内细胞团的多能干细胞，具有分化为体内所有类型细胞包括生殖细胞在内的能力。有关干细胞向生殖细胞诱导分化的研究最早始于三个最初出版物的报道，即研究人员采用拟胚体(embryoid body,EB)培养方式[10-12]，在体外将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)诱导分化成类卵原细胞或精子细胞，不仅具有与卵原细胞和精子相似的形态结构，还能检测到生殖细胞相关的VASA、Sycp3、Dmc1和FE-J1等特异标记物的表达。需指出的是，可能由于初期研究方法不够成熟及其他条件的限制等，导致诱导分化的成功率一般很低，因此以上三个研究均未对其后续受精、胚胎发育能力做进一步报道。

此后，研究人员不断对诱导培养方法加以改进、优化，证实了mESCs通过早期体外培养、后期移植到体内发育相结合的方式可获得不同发育阶段的生殖细胞，进而借助体外成熟、受精及移植后可获得健康子代小鼠出生[13]。随着研究不断深入，有一结论被研究人员普遍接受，即由小鼠PSCs(主要包括ESCs和iPSCs)先经历培养至外胚层样细胞(epiblast-like cells,EpiLCs)再生成原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell like cells,PGCLCs)，然后将PGCLCs与性腺体细胞结合培养是目前认为诱导mFGCs最有效的方法[14-15]。

然而，也有研究人员对使用ESCs进行科学研究操作持反对意见。Ciccocioppo等[16]认为分离ESCs过程涉及到对囊胚的破坏，以及干扰胚胎发育过程是一种不道德行为。Sheikhansari等[17]也指出，一方面虽然ESCs是所有干细胞中最具有多能性、具有无限分化成各种细胞类型的能力；但另一方面，正是由于其有无限增殖的潜能，诱导分化过程同时可能导致畸胎瘤甚至癌症发生的风险。因此，考虑到以上伦理和安全等方面问题，ESCs在临床上的应用受到很大限制，特别是有学者在体外成功诱导出iPSCs后，研究人员也就慢慢忽视了其在干细胞研究中的使用价值，而逐渐转向使用iPSCs作为替代来源进行研究[18]。

3.2 iPSCs向FGCs诱导分化 iPSCs是通过将外源特定基因或转录因子导入已经分化成熟的体细胞进行重编程而形成的人工干细胞，具有与ESCs相似的发育潜能。2006年，Takahashi等[19]首次报道将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子导入小鼠成纤维细胞后成功诱导出前者来源的多能干细胞，即miPSCs。由于iPSCs来源广泛，同时可避免因ESCs研究而带来的伦理问题以及干细胞异体移植治疗时存在的免疫排斥等问题，因此被越来越多的研究人员所重视，逐渐将其视为进行ESCs研究的良好替代来源[20]。此后，不同研究人员对iPSCs进行了更加深入的研究。

最近，Hikabe等[21]采用“两步法”培养策略，即向培养液中添加基础成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和激活素A先将iPSCs培养至EpiLCs，随后在含BMP4、SCF、LIF、EGF培养液中继续培养至PGCLCs。结果显示iPSCs衍生而来的MⅡ卵母细胞具有正常受精能力，并能发育到妊娠足月。总体来说，目前研究人员对iPSCs向生殖细胞的分化已做了大量研究，而且大多以小鼠动物模型为研究对象。而将人类iPSCs诱导分化为FGCs仍具有挑战性。因为在自然条件下，由干细胞向生殖细胞分化是一个漫长过程，包括在子宫内(囊胚阶段)和胎儿体内发育过程及具体调控机制，目前研究人员在体外尚且难以完全模拟上述发育过程[22]。而Dyce等[23]研究具体指出，由干细胞向生殖细胞诱导分化的步骤中，减数分裂是一个在体外难以概括的生物学过程。因此，研究人员一般采用由iPSCs与小鼠胚胎卵巢颗粒细胞重建的“异构卵巢”共同培养，且4个月后可分化成人类卵原细胞，并显示出与体内生殖细胞相似的分化特征。尽管如此，Yamashiro等[24]认为，由于小鼠和人类之间存在种间差异，导致小鼠体细胞和hPGCs之间的信号传递不能完全兼容，因此无法完全支持人类卵子的发生。也就是说，异构重组卵巢培养方法并不是人类配子发生的有效系统。因此，开发一个没有异种组织的单倍体细胞生成系统可能是一个有效的解决方案，即可以通过hiPSCs诱导分化为hPGCLCs同时，与另一hiPSCs分化来源的人卵巢颗粒细胞(代替小鼠颗粒细胞)共同培养而实现。然而，假如这种"创造性"的研究方案成功实施，即人工制造卵子用于受精、妊娠以及顺利分娩，也就从本质上绕开了人类正常的"两性生殖"过程，是否会导致其他生殖伦理问题还需要研究人员保持警惕。目前有关iPSCs的研究还只是作为一种干细胞向生殖细胞分化研究的一种辅助平台，所以iPSCs在生殖研究领域能否发挥更多作用，还需科研人员进一步的探索和实践。

最近，Hamazaki等[25]研究发现，添加Figla、Sohlh1、Sohlh2、Lhx8、Nobox、Taf4b、Yy1、Tbpl2等8种转录因子的培养液可将hPSCs直接转化为卵母细胞样细胞(oocyte-like cells,OLCs)，无需经历先将其培养至PGCs、然后再分化为卵母细胞的过程。虽然研究中显示OLCs具有正常受精及卵裂能力，但未能验证其是否能获得活产。因此，这一成果是否具有推广应用研究的可行性，还需要更多的研究论据来支持。

3.3 OSCs向FGCs诱导分化 自2004年Johnson等[26]首次报道雌性小鼠卵巢内发现OSCs，至今十几年来，关于小鼠和人类卵巢中是否存在OSCs以及对其分离、检测的研究，不仅在生殖医学、干细胞生理学以及临床医学领域带来了很大热情，同时也导致了很多研究人员的怀疑和争议。Johnson等[26]最初研究显示，卵巢中存在直径5～8μm的OSCs，并有“减数分裂”特异蛋白SCP3的表达。而Virant-Klun及其小组成员研究表明[27]，卵巢表面上皮确实有OSCs的存在，但与Johnson等报道OSCs有所不同，因为这类细胞直径仅为2～4μm，且其与ESCs有相似的DDX-4标记物表达。有研究得出完全相反的结论，即Wagner等[28]对人类卵巢皮质进行单细胞分析研究，发现卵巢中有不同的细胞群，但没有OSCs存在。但越来越多的研究表明[28]，小鼠和人类卵巢中确实存在极少量OSCs。最近Bhartiya等[7]通过对不同学者的研究结果进行汇总分析得出结论，小鼠和人类卵巢中应该存在两种不同类型的干细胞，即包括较大尺寸(直径5～8μm)的OSCs(具有细胞质OCT-4B)和较小尺寸(直径2～4μm)、表达细胞核OCT-4A的极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSELs)。并且Bhartiya还指出，围绕是否存在OSCs的争议，可能与不同研究人员分离细胞的技术程序不恰当有关。进一步研究认为，VSELs可能是胚胎外胚层来源的PSCs，数量极少，继续分化可产生包括OSCs在内的组织特异性祖细胞。由于其在体外培养中表现相对静止，因此也被认为是卵巢中最原始的干细胞；而OSCs(表达FSHR3受体)在体外培养时，则会经历快速分裂并能在其分化为卵母细胞前形成生殖细胞巢(germ cell nests)。

最近，Silvestris等[29]从19例绝经期和13例非绝经期女性卵巢皮质中分离出的OSCs体外研究结果显示，来源于卵巢表面OSCs培养21天时可分化为成熟OLCs。随后使用5号以及X染色体探针通过原位荧光杂交技术对其染色体的倍性含量进行分析，结果支持OLCs为单倍体核型，由此证明了OSCs分化为OLCs的可行性。

4 目前研究存在的问题

对于干细胞向生殖细胞的分化研究，虽然研究人员已经积累了十几年的经验，但仍然存在很多棘手问题。首先，诱导分化成功率一直很低是主要问题[4,30](成功率通常<5%)；其次，至今仍然缺乏一个标准统一的模型和诱导分化方案。由上可知，目前用于研究的干细胞主要包括ESCs、iPSCs、OSCs以及VSELs等，由于不同来源的干细胞具有不同的分化潜能以及生长代谢机制，因此应选择哪种来源的干细胞进行研究才能获得最佳诱导效率，不同研究人员之间尚未达成共识。

而Bharti等[18]认为，相对于ESCs和iPSCs两种来源的干细胞，OSCs和VSELs应是最佳的诱导干细胞的材料来源。一方面，因为前两者具有高度多能性，因此其诱导分化过程导致畸胎瘤、癌症的风险则会相对较高，所以选择后两种来源的干细胞进行诱导更为合适；而另一方面，由于OSCs和VSELs直接来源于卵巢组织，更具有向OLCs分化的自然倾向性，因此在最少的培养条件下就能容易地分化为OLCs，同时还能在一定程度上节约研究资源和时间。因此，从目前研究现状来看，如何提高干细胞诱导分化的成功率是亟待解决的首要问题，也是研究人员、临床医生以及寻求干细胞治疗患者必须要面对的问题。

5 展 望

目前，世界各地的研究人员正在尽最大努力使诱导分化方案标准化，以期获得更安全和更理想的分化效果。随着医疗及科学技术的进步，干细胞再生与转化技术必将日趋成熟，同时干细胞诱导分化为生殖细胞的成功率大大提高，进而为卵巢早衰、癌症放化疗后严重损伤生育力导致的生殖细胞缺乏不孕夫妇患者，以及绝经期后被内分泌紊乱疾病所困扰的老年女性带来更多的希望和生活信心。