铁死亡在骨肉瘤中的应用前景*

全桦红 综述，王静成，李小磊，颜连启 审校

(江苏省苏北人民医院骨科，江苏 扬州 225001)

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，常见于年轻人，5年生存率为60%～70%，肺转移导致的病死率为30%～40%。骨肉瘤的常规治疗方法为手术切除、化疗和放疗。然而，骨肉瘤患者的预后自化疗以来，骨原性肉瘤的存活率在过去30年中无改变[1]。因此，开发新的改善骨肉瘤患者预后的治疗方法对提高骨肉瘤患者生存率具有重要意义。近年来，有研究表明，促进细胞发生铁死亡是一种很有前途的降低癌细胞耐药性的方法。铁死亡是一种新的非凋亡调控的细胞死亡方式，其特征是铁依赖性的脂质氧化物异常蓄积，在治疗癌症特别是间质性肿瘤中显示出巨大的应用前景[2-3]。体内外实验发现，铁死亡对退行性疾病相关的病理细胞死亡(如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森病)、卒中、脑出血、创伤性脑损伤、缺血再灌注损伤和哺乳动物肾脏退化及各种类型的肿瘤均有不同的生理效应[4]。铁死亡可能替代已有细胞死亡途径克服现有化疗药物的耐药性，提供新的药物靶点或与其他抗肿瘤药物联合作为辅助治疗骨肉瘤[5-6]。在此，将铁死亡对骨肉瘤癌的抗肿瘤作用及其作用机制综述如下。

1 铁死亡的发现

细胞死亡主要包括以下2种形式，分别为凋亡(也称为程序性细胞死亡)和坏死(不受控制的细胞死亡)[7]。铁死亡是2012年BRENT R.STOCKWELLl博士通过化学筛选发现的细胞死亡类型——细胞内铁依赖的脂质过氧化物大量蓄积而引起的一种独特的铁依赖的非凋亡细胞死亡[8]。铁死亡细胞具有独特的形态和生物能量特征，包括线粒体萎缩、线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少或消失，以及外线粒体膜破裂和细胞内各种氧化还原酶活性的缺失[9]。此外，作为细胞坏死关键的负调控因子的受体相互作用蛋白1/受体相互作用蛋白3或亲环素对细胞发生铁死亡过程无明显的抑制，而细胞自噬抑制因子3-甲基嘌呤也并不调节这一细胞死亡过程[6]。其可由实验化合物，如爱拉斯丁(Erastin)选择性致死小分子3(RSL3)或临床药物，如磺胺嘧啶、索拉非尼和青蒿琥酯在癌细胞和某些正常细胞，如肾小管细胞、神经元、成纤维细胞和T细胞中诱导[7]。铁死亡是一种全新的细胞死亡方式。此外，一系列小分子已被发现能在多种癌症中促进癌细胞发生铁死亡和促进癌细胞对化疗药物的敏感性，不同种类的器官、组织对铁死亡似乎具有不同的效应[8-9]。

2 铁死亡的分子机制

铁死亡最初是在RAS基因突变癌细胞中被定义的[10-12]。2012年BRENT R.STOCKWELLl博士发现了2个结构不相关的小分子，分别名为Erastin和RSL3，其对致癌的RAS突变细胞系具有选择性致死作用，并将其统称为RAS选择性致死(RSL)化合物[13-15]。然而，突变的RAS基因似乎对铁死亡的发生并不是必不可少的，一些没有RAS基因突变的癌症类型对铁死亡的诱导也很敏感。

2.1半胱氨酸合成谷胱甘肽(GSH)通路在铁死亡启动过程中起主导作用(Erastin诱导途径) Erastin是在化学筛检中发现的可诱导致癌RAS突变细胞系发生铁死亡的小分子之一[6，16]。在Erastin诱导的铁死亡过程中谷氨酸-半胱氨酸转运体也被称为X-C系统，是Erastin分子最重要的作用靶点，胱氨酸(细胞内半胱氨酸的主要形式)主要以1∶1的比例通过谷氨酸-胱氨酸转运体转入细胞内，然后在细胞内合成GSH和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)，细胞在保护自身免受氧化破坏过程中主要以GSH作为辅助因子，GPX4催化脂质过氧化物还原为醇类物质[17]。HAO等[18]在研究铁死亡在胃癌细胞系中作用机制时发现，沉默半胱氨酸二氧酶1(CDO1)可抑制Erastin诱导的胃癌细胞铁死亡。抑制CDO1可恢复细胞GSH水平，阻止活性氧(ROS)的生成，并降低脂质过氧化物的最终产物之一的丙二醛。此外，沉默CDO1在Erastin处理的细胞中可维持线粒体形态稳定。部分类型的细胞对Erastin诱导的铁死亡具有抵抗性，可能是因为这些细胞可通过其他途径获得半胱氨酸。半胱酰胺-转运RNA合成酶是一种细胞内消耗半胱氨酸进行蛋白质翻译的酶，HAYANO等[19]在研究铁死亡发生机制中发现，敲除半胱酰胺-转运RNA合成酶的生成基因后显著抑制了由Erastin引起的铁死亡。值得注意的是，应用GSH合成酶抑制剂抑制后也能导致细胞发生铁死亡[12-13，20]。Erastin诱导的铁死亡主要通过抑制细胞膜转铁蛋白受体-1(TFR1)上的谷氨酸-胱氨酸转运体系统，减少胱氨酸被转入细胞内，GSH合成减少，GPX4催化活性降低，导致过氧化物积累从而促使细胞发生铁死亡，也说明铁死亡是一种全新的细胞死亡方式。

2.2GPX4失活是铁依赖和脂质过氧化物积累的原因 一般而言，GPX4是铁死亡机制的中心调节器，而GPX4活性的缺失是由2种不同的机制介导的。第1个机制是Erastin诱导的谷氨酸-胱氨酸转运体系统被抑制后细胞内GSH大量被消耗，GPX4活性缺失，导致细胞内致死性脂质氧化产物(磷脂双分子层被氧化破坏的产物)异常蓄积，最终引起细胞ROS稳态被破坏，细胞发生铁死亡[21]。第2个机制是以GPX4为目标靶点。以RSL3通路机制为例，有研究表明，RSL3诱导的铁死亡过程中细胞内GSH水平无明显变化，与Erastin效应截然相反。但细胞内仍有大量脂质ROS的生成，表明脂质氧化存在于Erastin和RSL3 2条不一样的通路。通过Erastin实验对蛋白质组分析发现，GPX4是RSL3的直接靶点，通过与GPX4直接共价结合抑制GPX4的交流活性，导致脂质过氧化物的积累[22]。为进一步验证，IMAI等[23]在实验中同时敲除和过表达GPX4目的基因，分别得到2组细胞产生对铁死亡敏感性和抗性增强等截然不同的结果，而被敲除目的基因的细胞组在分别用RSL3抑制剂和铁螯合剂处理后均能出现铁死亡抗性。相似的实验结果也在SUI等[21]研究铁死亡在结直肠癌的作用机制中出现，过表达GPX4抑制了RSL3处理引起的细胞铁死亡，表明抑制GPX4可能是RSL3诱导的结直肠癌细胞铁死亡的关键性决定因素。表明GPX4是由Erastin和RSL3诱导的铁死亡中心调控因子，其中以RSL3通路为主。

2.3脂质氧化物和ROS的蓄积是铁死亡的必要条件 脂质过氧化产物和多不饱和脂肪酸增加了膜的流动性，对原始生命适应环境非常重要，亚油酸和花生四烯酸等多链不饱和脂肪酸可被细胞内ROS氧化，导致脂质氧化分解产物的生成，刺激细胞发生RSL3诱导的铁死亡[24-25]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4通过氧化细胞膜磷脂的作用驱动胞吞作用，由其激活的含有2种脂肪酰基的花生四烯基，即肾上腺素基被证明是线粒体(尤其是线粒体上的铁死亡)的死亡信号[26]。在GPX4体内和体外的模型中只有一类磷脂酰乙醇胺被严格鉴定为诱导铁死亡的脂质类型。与此同时，多链不饱和脂肪酸的过氧化作用被证明是导致铁离子增多的主要原因。ROS是部分还原的含氧分子，包括超氧化物、过氧化物和自由基是细胞内信号传导、抗感染和癌细胞凋亡的重要二级信使。过量ROS通过抗氧化剂(酶解和非酶解)解毒，并在超氧化物歧化酶(铜锌超氧化物歧化酶、锰超氧化物歧化酶)、GPX和过氧化氢酶的催化下发生反应[27]。ROS生成和解毒速率的不平衡导致氧化应激和自由基的产生，从而破坏DNA、蛋白质和脂质。铁是氧化还原活性金属，可通过芬顿反应促进细胞内的ROS池，在芬顿反应中铁催化过氧化氢的分解，生成羟基自由基。在铁死亡中胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白失活和GSH降解导致铁依赖的ROS积累，ROS的积累会消耗大量的GSH，从而降低GPX4活性[28]。

2.4铁代谢是铁死亡的重要特征 铁作为酶发挥生物活性的重要组成部分，在DNA合成、代谢，细胞周期的连续性和血管再生等方面具有不可替代的作用。同时，嗜铁是铁死亡的一项基本属性，在诱导细胞铁死亡过程中铁作为一个氧化还原剂，通过芬顿反应促进ROS的生成。再者几乎所有脂质过氧化物均可被铁螯合剂消耗[28-29]。在生理条件下，铁最初在十二指肠系膜的肠腔内以二价铁离子(Fe2+)被吸收进入肠上皮细胞，随后以三价铁离子(Fe3+)被释放入体循环，最终通过膜上的TFR1受体进入细胞，参与细胞内各种生理化学反应。细胞内游离的Fe2+催化氢氧化氢形成和氢氧根，此反应以19世纪化学家亨利J.H.芬顿反应命名。有研究发现，芬顿反应和铁依赖酶均能产生ROS，其能触发氧化作用到邻近的生物分子，如蛋白质、DNA和脂质[25]。因此，铁螯合过程中细胞内铁的消耗不仅影响了氧基的一种来源，而且可能影响了大多数依赖铁的氧基来源。TFR1是一种跨膜糖蛋白同型二聚体，与Fe2+转铁蛋白结合，对铁的吸收和细胞生长调节至关重要。有研究发现，与非肿瘤干细胞比较，胶质母细胞瘤干细胞(CSCs)表达的TFR1及其配体转运蛋白水平更高。因此，CSCs对铁的吸收增加，提示铁死亡可能参与了CSCs的增殖和稳定[30]。其中调控TFR1和Fe2+转铁蛋白 mRNA被分别敲除后有效降低了Erastin诱导的细胞毒性。除增加铁的吸收外，细胞还可通过调节铁蛋白水平增加细胞内的铁，将多余的铁离子隔离储存，使铁离子在细胞内积聚，同时，防止铁离子介导的自由基反应[31]。而且铁蛋白在许多癌组织中存在过表达现象，包括乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤等。相反通过铁螯合剂减少细胞内铁储留可有效抑制铁死亡的发生。热休克蛋白-1通过在体内减少细胞内铁和脂质氧化产生ROS而阻碍细胞死亡。SUN等[32]研究表明，热休克蛋白-1 mRNA下调增强了铁死亡诱导Erastin途径的激活，表现出抗肿瘤活力。

3 铁死亡与骨肉瘤现有研究成果

3.1TFR1通过抑制信号传导与转录激活因子3/核因子红系2相关因子2(Nrf2)/GPx4信号通路诱导铁血症增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性 LIU等[33]在骨肉瘤对顺铂的敏感性研究中发现，促进骨肉瘤细胞发生铁死亡可增强靶细胞对顺铂的敏感性。进一步研究发现，使用铁死亡激动剂、Erastin RSL3处理显著顺铂耐药株后铁死亡负调控因子，如磷酸化的信号传导与转录激活因子3(信号转导因子和转录激活因子1)、Nrf2、GPx4蛋白水平显著降低，细胞内铁死亡标志性分子，如丙二醛、ROS、脂质氧化物的生成和对顺铂的敏感性显著增加。同样采用铁死亡抑制剂处理非耐药株后骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性增强。说明铁死亡为体外减弱骨肉瘤对顺铂的耐药性提供了新的途径。

3.2TFR1是改善骨肉瘤患者的预后因素 WU等[34]报道了TFR1在骨肉瘤中高表达，并进一步证实了TFR1的高表达与肿瘤的组织学分级、分期和远处转移显著相关。铁代谢异常与细胞发生铁死亡机制密切相关，而铁稳态主要由铁的吸收、利用和储存平衡所维持。TFR1是铁吸收的主要蛋白，TFR1的免疫组织化学染色结果提示，肿瘤患者癌细胞中有较高的铁吸收率。近年来，有研究表明，TFR1在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤等多种肿瘤中均有高表达，且患者预后较差[7]。TFR1在骨肉瘤组织中表达较高，且与骨肉瘤患者恶性程度相关。为TFR1有可能作为骨肉瘤新的治疗靶点提供了一定的理论依据。

3.3超顺磁氧化铁颗粒的过吞作用在纺丝磁场作用下可增加人骨肉瘤细胞凋亡并触发自噬性细胞死亡 超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)的毒性仍是一个重要的争论话题，其机制尚不清楚。DU等[35]研究表明，过量SPIONs可诱导骨肉瘤细胞死亡，并且当与旋转磁场(SMF)相结合时这种效应被增强了；实验发现，过量SPIONs诱导ROS的生成，以及SPIONs和SMF联合诱导生成过量的ROS；而且SPIONs处理的细胞中线粒体电位显著降低，而联合SMF组线粒体电位损失更大，ROS生成明显高于凋亡率，提示细胞死亡方式不仅是凋亡；同时，透射电子显微镜分析结果显示，SPIONs在线粒体周围聚集，在SPIONs处理的细胞中有很多肿胀的线粒体，也是线粒体功能障碍的证据，说明实验观察到的细胞死亡可能源于线粒体功能障碍；有研究发现，非磁场作用下SPIONs处理的细胞能通过ROS诱导的细胞死亡，而SMF作用下的SPIONs处理的细胞经常发生自噬性细胞死亡和凋亡；最后，用瘤内注射的方法观察了SPIONs对异种移植小鼠的影响，结果显示，联合SMF组可显著降低小鼠肿瘤体积，延长小鼠寿命。SPIONs联合SMF通过ROS途径刺激癌细胞发生的死亡不是传统意义的细胞凋亡或自噬，而是以细胞内脂质氧化物蓄积过多，线粒体膜的脂质双分子层被氧化，膜的完整性、流动性、通透性被破坏，而铁参与则进一步促进了脂质氧化物的形成诱导的细胞铁死亡。

4 小 结

虽然通过促进细胞凋亡使细胞对抗癌药物的敏感性有了一定程度的提高，但许多癌细胞对抗癌药物仍表现出较强的耐药性，其机制尚不明确，尤其是在临床环境中。越来越多的文献报道了癌细胞耐药与抑制铁死亡的关系，铁死亡表型现已被报道在许多癌症中存在，如乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌及其他癌症等。而越来越多的实验证明，铁死亡有效地抑制了癌症细胞的增殖和转移，且不同类型癌症的敏感性不同，间质性肿瘤敏感性较强。

铁是促进细胞增殖和维持正常细胞周期过程所必需的微量元素，而这些过程的促进在一定程度上支持了癌细胞对铁的依赖性增强。铁是产生氧化应激的必需物质，氧化应激是铁死亡的特征，尽管铁的确切作用仍是推测性的，但实验已发现对顺铂耐药的骨肉瘤细胞存在对铁依赖的抑制，这种抑制可能是导致细胞对顺铂耐药的原因，因此，骨肉瘤(和其他癌症)生长和侵袭所需的铁水平的提高可能是癌症治疗的致命弱点。

铁死亡在骨肉瘤中具有非常重要的作用，STAT3/Nrf2信号的过度激活可能介导了顺铂耐骨肉瘤细胞抗氧化能力增强，通过抑制STAT3/Nrf2/GPx4信号通路诱导铁死亡增强了骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性，TFR1抑制了骨肉瘤细胞的增殖和远处转移，大大改善了患者预后。因此，使用铁离子诱导剂治疗骨肉瘤，无论是单独或与传统疗法相结合，铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式在一定意义上为癌症的靶向治疗提供了新的治疗靶点。