辅助生殖技术中促性腺激素释放激素激动剂扳机的研究进展*

邢 泽，焦 娇，孙弘昊，王秀霞

(中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110021)

对于体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)、胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、宫腔内人工授精(intrauterine insemination，IUI)等辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)，准确掌握患者的排卵时间对改善妊娠结局十分重要[1],这些技术的应用都需要为患者制定个性化的扳机方案。对于体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)患者，传统的扳机方法为人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)扳机，即应用HCG模拟生理性LH峰的形成，诱导卵母细胞排出第一极体，进而促进卵母细胞最终成熟及黄体形成。但HCG半衰期较长，增加了卵巢高反应患者发生卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)的风险[2]。近年来有学者提出，应用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a)扳机可降低OHSS发生率[3-6]。但GnRH-a扳机也有一定的局限性，其不适用于长方案降调节的患者。此外，GnRH-a扳机与黄体功能障碍密切相关，其触发的LH峰时间较短，不足以维持黄体功能，可能导致新鲜周期胚胎种植率和临床妊娠率降低。有研究表明，GnRH-a联合HCG双扳机是促进卵母细胞最终成熟的更佳选择，这种扳机方案可以在避免OHSS的同时改善妊娠结局[7-8]。临床医师应综合评估患者卵巢刺激前及卵巢刺激期间的卵巢大小和激素水平，为患者选择合适的扳机药物进行扳机，以改善患者的卵子质量、降低并发症的发生。本文就辅助生殖技术中GnRH-a扳机的研究进展做一综述。

1 使用GnRH-a扳机明显降低OHSS的风险

接受IVF/ICSI助孕进行控制性促排卵的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者，是OHSS的高危人群。OHSS不但增加患者的痛苦，同时产生额外的医疗费用，尤其对于重度OHSS患者，可能有严重并发症的发生，甚至危及生命。GnRH-a扳机与HCG扳机均为诱发体内LH峰形成，高浓度的LH峰既可诱发卵母细胞进行减数分裂成为次级卵母细胞，同时可促进相关促排卵物质分泌，使卵丘和颗粒细胞分离，为卵细胞的排出提供条件，是卵子成熟及排卵的重要条件。GnRH-a与垂体GnRH受体结合，形成一过性升高(flare-up)效应，诱导内源性LH峰的形成及FSH分泌，其诱导激素分泌的模式更接近自然周期排卵激素分泌[9]。Humaidan等[10]对118例患者的随机对照研究表明，HCG扳机组OHSS发生率为3%，GnRH-a扳机组无OHSS发生。Gonen等[4]报道了对于应用拮抗剂方案进行控制性促排卵(controlled ovarian stimulation，COS)的患者，使用GnRH-a扳机能有效诱导卵母细胞最终成熟，并显著降低OHSS的发生率。值得一提的是，单用GnRH-a扳机相比于GnRH-a联合HCG双扳机，OHSS发生风险更低[11]。Deng等[12]纳入了21例扳机日≥11mm的卵泡数目≥30个和(或)雌二醇峰值≥10000pg/mL的OHSS高风险患者，采用首次GnRH-a扳机后12h再次GnRH-a扳机，并于取卵当日开始每天注射0.25mg GnRH antagonist(GnRH-ant)，所有纳入患者均未发生中度至重度OHSS，并且患者的性激素水平和超声检查结果均有改善。

有学者认为，OHSS的发病机制是HCG激发卵巢释放大量的血管活性物质，如组织胺、前列腺素和各种细胞因子等[13]，导致血管内皮功能受损，血液动力学改变，血管通透性增加，血液浓缩，液体停留在第三间隙，引起水电解质紊乱、血栓栓塞等并发症，严重者导致死亡。为降低OHSS的风险，促排卵周期中会采用GnRH-a扳机、胚胎冻存、Coasting方案、未成熟卵母细胞体外培养(in vitro maturation，IVM)及取消周期等方式。

在COS患者中，胚胎冻存能减轻早发型OHSS的程度，对于极高危患者，可减少晚期发生OHSS的风险。Borges等[14]的促排卵周期中，移植新鲜胚胎与冻存胚胎的妊娠率和种植率无明显差异，但移植冻存胚胎患者的OHSS发生率更低。相反的是，对于卵巢低反应的患者，考虑治疗周期及治疗费用，建议优先考虑鲜胚移植。Coasting方案是指在促排卵过程中血清E2水平过高、卵泡数目过多时停用Gn，而促性腺激素释放激素类似物继续使用，待血清E2水平降到安全值(E2<3000pg/mL)时继续使用HCG，使小中卵泡发生闭锁，大卵泡继续发育，减少了对卵巢的刺激，也减少了卵泡血管活性物质的释放，降低中重度OHSS的发生。但其预防OHSS的效果有限，并且可能导致患者获卵数减少[15]。IVM是指将GV期或MⅠ期的卵母细胞在体外培养发育到第二次减数分裂中期(MⅡ期)，使之能正常发育、受精和着床。卵母细胞在体内的成熟过程极为复杂，染色质结构、线粒体分布等多种因素均可影响卵母细胞成熟度[16]，卵丘细胞可调控卵母细胞的减数分裂抑制与恢复[17]。与在体内成熟相比，经IVM的卵母细胞细胞核与细胞质成熟的同步性较差，受精率及卵裂率偏低[18]。取消周期虽能阻止OHSS的发生，但对于患者而言，浪费时间和金钱。

GnRH-a可能通过刺激颗粒细胞抗血管生成因子色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)的表达，抵消血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，诱导黄体溶解和减少LH分泌来降低雌激素水平，从而预防OHSS的发生[19-20]。此外，PEDF可能通过刺激多巴胺受体激动剂来降低OHSS的风险[21]，进而缩小取卵后卵巢体积，减轻患者腹胀腹痛，缩短取卵后撤退性出血发生的时间，提高患者临床治疗的舒适性。GnRH-a扳机相比于传统HCG扳机更具优势，其既不影响卵母细胞成熟度，又降低OHSS的风险[22-23]，现已广泛应用于临床。

2 GnRH-a联合HCG双扳机提高卵母细胞成熟率，提高临床妊娠率和活产率,明显改善妊娠结局

应用GnRH-a扳机虽可降低OHSS发生率，但其溶黄体作用和相对较短的半衰期可能导致胚胎种植率及临床妊娠率下降[24]。为解决这个问题，Griffin等[25]在OHSS风险的卵巢高反应人群中比较应用GnRH-a联合低剂量HCG双扳机和单独应用GnRH-a扳机的临床结局。结果显示，双扳机组(GnRH-a+1000IU HCG)的活产率(52.9% vs 30.9%)，种植率(41.9% vs 22.1%)和临床妊娠率(58.8% vs 36.8%)显著提升。此外，Lin等[26]提出了GnRH-a联合标准剂量HCG双扳机。与HCG扳机组相比，双扳机组(GnRH-a+HCG 6500IU)在统计学上显示出较高的种植率(29.6% vs 18.4%)、临床妊娠率(50.7% vs 40.1%)和活产率(41.3% vs 30.4%)。即在卵巢高反应的患者中，GnRH-a联合标准剂量或低剂量HCG双扳机均可提高受孕和活产的可能性。2014年，Griffin等[27]对IVF/ICSI周期中曾获得超过25%未成熟卵母细胞的患者应用GnRH-a联合标准剂量HCG双扳机，提高了其成熟卵母细胞百分率(75.0% vs 38.5%)。相似的是，Seval等[28]研究显示,双扳机组(GnRH-a+重组HCG 250ug)的成熟卵子数显著高于单扳机组(重组HCG 250μg)。近年来的研究同样显示[29]，对于有IVF/ICSI周期低反应病史的患者，GnRH-a联合HCG双扳机显著提高卵母细胞成熟率或妊娠率。

以上研究结果证实了GnRH-a在双扳机中的作用，这可能是由于GnRH-a的释放FSH效应在卵母细胞最终成熟阶段至关重要[30-32]。Humaidan等[33]研究表明，黄素化颗粒细胞可经FSH峰的诱导生成LH受体，FSH峰也可促进卵母细胞最终成熟及卵丘细胞扩张。Zelinski-Wooten等[34]的灵长类动物研究提示，单独由FSH峰诱导同样可促进卵母细胞发育及成熟。可以推测，GnRH-a联合HCG双扳机可以提高卵子成熟率，进而提高种植率、临床妊娠率及活产率，改善妊娠结局[35]。

3 GnRH-a联合HCG双扳机降低了空卵泡综合征(empty follicle syndrome，EFS)的风险

Coulam等[36]1986年首次发现了EFS，是指在COS周期中，卵泡发育水平及雌激素增长水平正常，取卵日血人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-HCG)正常，但经多次抽吸和反复冲洗成熟卵泡均无法获得正常卵母细胞的一种现象[37]，其发病机制尚不清楚，可能是多种因素协同作用的结果，或与HCG有效性降低、遗传因素或基因突变、卵母细胞成熟障碍有关。HCG生产过程中生物学活性降低、使用过程中注射剂量不足或注射时机选择不当，患者肝脏对HCG敏感性过强或过弱都可能导致HCG不能正常发挥其生物学效应，从而导致EFS。Inan等[38]提出在复发性EFS患者颗粒细胞中有160种基因表达是非EFS患者的2倍以上，这些差异性表达的基因大多参与细胞生长和凋亡，由此推测EFS的发生可能与凋亡基因表达升高和相应的调节卵泡正常生长发育的转录产物水平降低所致。Desai等[39]报道了1例31岁原发不孕女性应用HCG扳机后，在卵母细胞回取过程中，在卵巢中发现200多个窦前卵泡样结构，这些结构通过电子显微镜进一步观察发现卵泡中没有卵母细胞，仅有一个易于识别的透明带，体外培养激素测定表明这些卵泡分泌雌二醇，推测是由卵母细胞成熟障碍从而导致EFS发生。在月经周期中，FSH峰和LH峰协同作用，促进卵母细胞最终成熟；而HCG扳机是模拟LH峰的生理学作用。此类患者或可考虑应用GnRH-a联合HCG进行扳机[40]，其与HCG扳机的区别在于GnRH-a可以提供HCG扳机所缺乏的释放FSH的效应。

Beck-Fruchter等[41]报道1例复发性EFS患者，应用GnRH-a联合HCG双扳机后，获得16枚成熟卵母细胞并成功受孕。Fatemi等[42]研究表明，前次周期HCG扳机发生EFS的27例患者，二次周期时使用GnRH-a联合HCG(5000～10000IU)扳机，取卵当日获得MⅡ卵数明显多于前次周期；另有两项研究[43-44]也报道了相似的结果，在既往发生EFS的患者中应用GnRH-a联合HCG双扳机，可提升卵母细胞成熟率、着床率和妊娠率。可推断应用GnRH-a联合HCG双扳机可解决颗粒细胞功能障碍，可能在一定程度上降低EFS的风险。

4 GnRH-a扳机可能导致黄体功能不足，需使用个性化的黄体支持方案以改善患者新鲜周期移植的妊娠结局

自然周期的黄体中期LH平均水平约为6IU/L，而GnRH-a扳机后，LH平均水平约为1.5IU/L[10,45]，该水平不足以支持黄体功能，最终导致不良生殖结局[46-47]。在黄体期，LH起着至关重要的作用，决定着黄体生成类固醇的生物学活性[48]，如上调血管内皮生长因子A(vascuoar endothelial growth factor A，VEGFA)、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)[49]和与植入有关的细胞因子[50]。生理性LH峰出现于卵泡破裂前34～36h，持续48～50h。LH至少需维持14～27h，才能确保卵母细胞的完全成熟。此外，LH峰对于排卵后孕酮分泌和黄体形成至关重要。GnRH-a扳机触发的LH峰的时间较短(24～36h)，低于生理性LH峰的持续时间(48～50h)，同时半衰期短(1h)，可导致黄体功能不足，黄体中期的LH水平低于自然周期约75%，进而导致卵泡成熟及胚胎种植障碍[9]。一项研究表明[51]，GnRH-a不仅可用于诱导卵母细胞最终成熟，而且可用于冻融周期胚胎移植的黄体支持，最终在持续妊娠率及活产率方面得到满意效果。一项回顾性研究探讨了GnRH-a扳机与HCG扳机在同一患者的不同IVF/ICSI周期中的关系，认为GnRH-a扳机结合适当的黄体支持是促卵母细胞最终成熟的更好选择[52]。因此，GnRH-a扳机的患者如进行新鲜周期胚胎移植，需辅以改良的、个性化的黄体支持方案[53]。

4.1 刺激内源性类固醇产生 通过外源性HCG补充促进黄体产生内源性类固醇的方法被称之为“欧洲方法”，但取卵后HCG的应用会增加OHSS的风险[54]。多年以来，科学家们进行了大量工作以寻找用于挽救扳机后剩余的黄体功能的最低HCG剂量，从而使新鲜胚胎植入后产生的HCG足以满足黄体LH活性同时又不增加OHSS的风险[55]。

4.2 外源性类固醇支持 GnRH-a扳机后，仅依赖于外源性类固醇补给的方法被称之为“美国方法”。Iliodromiti等[56]回顾性分析748例高风险OHSS患者，实验组为363例患者使用GnRH-a进行扳机，于黄体期给予外源性类固醇支持，对照组为257例患者使用HCG扳机联合常规黄体支持。结果显示，实验组与对照组的活产率无明显差别(29.8% vs 29.2%)；实验组发生1例迟发型OHSS(0.3%)，对照组发生18例迟发型OHSS(7%)。推测GnRH-a扳机后联合外源性类固醇支持可明显降低OHSS发生率，是否改善妊娠结局还需进一步大样本RCT的深入探讨。

4.3 重组LH(rLH)应用于黄体支持 在GnRH-a扳机后的黄体支持方案中，由于rLH相比于HCG半衰期更短，故使用rLH可能会降低OHSS的风险。一项随机对照试验[57]探讨了GnRH-a代替HCG扳机后应用rLH和孕酮补充黄体功能的新方法对于提高种植率方面的有效性。将17例患者随机分入对照组，给予250μg重组HCG扳机，并给予标准的黄体支持方案(阴道用微粒化黄体酮600mg/d)；将18例患者随机分入实验组，使用GnRH-a扳机，在黄体期隔日给药300IU rLH，直至取卵后10天，共给药6次，并联合使用标准的黄体支持方案，实验组及对照组患者均接受单囊胚移植。结果显示，两组的种植率相似(31.2% vs 26.7%)，两组均无OHSS发生，但该研究纳入患者均为卵巢正常反应患者，rLH应用可否降低卵巢高反应人群OHSS发生率，仍需深入研究。

4.4 根据患者卵巢功能制定个性化的改良黄体支持方案 Humaidan等[58]进行了一项多中心随机对照研究。纳入的390例患者进行了四个组的比较：高OHSS风险A组，高OHSS风险B组，低OHSS风险C组，低OHSS风险D组。A组(n=60)使用0.5mg GnRH-a扳机，并于取卵当日单次皮下注射1500iu HCG；B组(n=58)使用5000iu HCG进行扳机；C组(n=125)使用0.5mg GnRH-a扳机，并于取卵当日两次皮下注射1500iu HCG；D组(n=141)使用5000iu HCG进行扳机。结果显示，高OHSS风险A组和低OHSS风险D组无发生OHSS病例；高OHSS风险B组发生2例中度迟发型OHSS(3.4%)；低OHSS风险C组发生2例迟发型OHSS(1.6%)。因此，对于低OHSS风险的患者，需进行个性化的精细HCG剂量调整以保证临床妊娠率、不增加OHSS发生率。

综上所述，GnRH-a扳机可诱发体内LH峰及FSH峰的形成，使排卵更接近于生理周期，同时降低了OHSS的风险。应用GnRH-a联合HCG双扳机能明显提高卵子成熟率，进而提高临床妊娠率和活产率。此外，GnRH-a联合HCG双扳机还可降低EFS的发生率。但应用GnRH-a扳机可能导致黄体功能不足，导致鲜胚移植率降低，流产率升高。为提高使用GnRH-a扳机患者的胚胎植入率及持续妊娠率，需关注黄体期的激素水平并进行适当的黄体支持。GnRH-a扳机与HCG扳机最终整倍体率相近[59]，且获得的整倍体胚胎怀孕潜力相同[60]，把握最佳的扳机时机合理应用GnRH-a进行扳机并制定个性化的黄体支持方案，有望使GnRH-a替代HCG成为ART的一线扳机药物。