免疫评分系统在结肠癌中的应用研究进展*

龚惠英，周 睿，张 涛 综述，李龙浩 审校

(重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆 400016)

结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，居男性第3位、女性第2位[1]。其中结肠癌每年新增120多万病例，死亡人数达60多万，是导致癌症死亡的第5大恶性肿瘤[2]。目前,结肠癌常用的分期系统是美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟的TNM分期。越来越多的临床资料显示，同一类型肿瘤相同分期的不同患者经过相同或类似治疗后，其临床结局有显著差异[3]，这表明该分期在提供预后信息方面存在局限性。随后又提出了多种预后评估方法，包括根据肿瘤形态学、信号通路、基因表达状态等评估患者预后[4-5]。其中，根据基因表达状态、mirRNA等建立了多种数学预测模型，如Oncotype DX、ColoPrint评分系统等。这些模型具有较高的预后价值，但是由于其技术的成熟性、可及性、经济性等原因未能广泛应用于临床。目前，临床医生通常综合TNM分期、肿瘤位置、基因表达和错配修复功能状态等评估患者预后。随着对肿瘤微环境的深入研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在抗肿瘤治疗方面具有重要作用[6-7]。因此，有学者提出采用免疫评分系统评估肿瘤患者的预后情况。有研究表明，该系统的预后预测能力优于TNM分期，可进一步指导肿瘤患者治疗决策的制定。本文对免疫评分系统进行了系统综述，以期为肿瘤预后评估的选择提供一些思路。

1 癌症定义的演变

20世纪基于对基因组的认识，癌症被定义为参与细胞分裂、增殖的基因发生累积突变而引起的疾病。这一观点以癌细胞为中心，即无论其所处何种环境，只要其基因组发生突变都可导致该细胞发生不可逆的变化。有学者提出通过导入外源性正常基因来治疗癌症[8]。这为癌症的诊断、治疗提供了新策略，但其认识仍存在局限性。2000年，HANAHAN和WEINBERG发现了癌症的六大基本特征，即生长信号自给自足、对生长抑制信号不敏感、逃避细胞凋亡、无限复制潜能、持续血管生成、组织侵袭和转移。2011年又补充了4个特征：调控能量代谢、逃避免疫监视、促进肿瘤炎症、基因组不稳定和突变[9]。这一发现让人们对癌症有了更加全面的认识。癌症不再仅由癌细胞定义，而以癌细胞及其微环境共同定义[3]。其中，肿瘤微环境由成纤维细胞、免疫细胞、炎细胞及其生物分子等组成，这些细胞通过直接接触或分泌细胞因子等方式影响癌症进展。研究表明，肿瘤预后与其微环境中免疫成分密切相关(主要指免疫细胞的密度、类型、分布区域和表型激活状态)，其中TIL密度与患者生存期呈正相关[10-12]。

2 免疫评分系统的发展

有研究通过高通量结肠癌微环境数据库分析发现，CD3、CD8、颗粒酶B(GZMB)等免疫相关基因与患者生存期密切相关，且在其组织切片中发现肿瘤中心和肿瘤浸润边缘(IM)CD3+、CD8+、CD45R0+、GZMB+细胞浸润密度与患者生存期呈正相关[13]。与单纯肿瘤区域肿瘤中心或IM相比，肿瘤中心和IM的联合分析明显提高了其预后准确性。基于以上发现，GALON等建立了免疫评分系统以评估肿瘤患者的临床预后情况。由于肿瘤内CD45R0+与CD3+T细胞浸润密度高度相似，且在制片和染色过程中CD45R0和GZMB抗原性易迅速丢失，最终将肿瘤中心和IM中CD3+、CD8+T细胞浸润密度作为评分依据。其具体方法是先从每个肿瘤组织样本取得2个同时包含肿瘤中心和IM的切片，分别进行CD3、CD8单抗染色；再利用免疫评分病理图像分析仪(将专门研发的免疫评分模件与数字病理软件的图像分析系统相结合)分别计算肿瘤中心和IM中CD3+、CD8+T细胞密度；利用SPSS软件分析确定最佳临界值以划分高密度(记1分)和低密度(记0分)，最后计算分数总和，即免疫评分(分值范围0～4分)[14]。为进一步优化该评分系统，将细胞密度转化为四分位数，再计算其平均值，即免疫评分。该评分系统有两种分类方法。在三分类评分系统中，0～25%、25%～70%、70%～100%分别为低、中、高免疫评分；二分类中，0～25%、25%～100%分别为低、高免疫评分。与二分类相比，三分类分组更详细，似乎有利于准确评估患者预后。除了评估复发风险、指导治疗决策外，免疫评分系统还具有重要的生物学意义，包括为新疗法提供作用靶点，预测多种抗肿瘤治疗方法疗效等[15]。与传统病理检测技术相比，免疫评分系统的数字化病理技术对TIL的测定更加准确[3]。

3 免疫评分系统的价值

为了促进免疫评分在临床实践中的应用，在癌症免疫治疗协会的支持下，全球免疫评分联盟(由全球13个国家和14个中心组成)对免疫评分的重复性、预测能力等进行验证，其主要研究终点为复发时间(TTR)，次要研究终点为总生存期(OS)、无病生存期(DFS)等。2018年，有研究纳入3 539份Ⅰ～Ⅲ期结肠癌样本进行制片、染色，经过质控后排除858份，余下2 681份(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别占17%、54%、29%)被随机分配至训练集、内部验证集和外部验证集，然后利用免疫评分病理图像分析仪得出其免疫评分。该研究结果显示：在训练集中，高、中、低免疫评分患者5年复发率分别为8%、19%、32%，5年OS率分别是82%、77%、62%，提示高免疫评分者有更低复发率、更长生存时间；在外部验证集中，高、中、低免疫评分的3年复发率分别为14%、24%、36%；内部验证集中也出现类似结果[16]。8位病理学专家随机对5个中心的数据进行验证，结果显示重复性良好。因此，免疫评分被认为是结肠癌TTR、DFS和OS的重要预测因子。Cox回归模型多因素分析显示，免疫评分是TTR的独立预后因素，且其预测患者OS的准确性优于TNM分期等因素。

研究表明，Ⅱ期结肠癌术后辅助化疗整体获益不高(≤5%)，因此对于术后是否需要进行辅助化疗存在较大争议[17]。目前，临床医生主要根据错配修复蛋白功能状态或微卫星不稳定状态和临床病理高危因素等将Ⅱ期结肠癌患者进行分组。“低危”组即错配修复功能缺陷或微卫星高度不稳定型(MSI-H)且无临床病理高危因素者，其预后通常较好，一般不推荐辅助化疗；“高危”组即错配修复功能完整或微卫星稳定型且具有临床病理高危因素者，其预后不佳，通常建议行辅助化疗。余下Ⅱ期患者即“中危”组，可选择单药化疗或观察[18]。然而实际上，一部分“高危”患者并未复发，而一些“低危”患者却出现了复发转移。显然，这种方法不能准确识别高危Ⅱ期患者。上述研究的亚组分析结果表明，免疫评分能更准确的识别高危Ⅱ期患者，使其从辅助化疗中获益，同时使低危Ⅱ期患者豁免辅助化疗。此外，该研究还发现MSI-H与高免疫评分存在相关性，这可能与MSI-H肿瘤高水平抗原负荷诱导的强烈免疫反应有关。

此外，法国国际辅助化疗持续时间评估(IDEA)队列研究发现，在Ⅲ期结肠癌中，相较于3个月mFOLFOX(氟尿嘧啶/亚叶酸钙+奥沙利铂)治疗，6个月疗程更具优势性[19]。在此基础上，PAGES等评估了免疫评分在mFOLFOX6亚组中的预后价值，该研究结果公布在2020美国临床肿瘤学会胃肠道肿瘤研讨会会议上，即低、中高免疫评分的3年DFS率分别为66.34%和77.66%，低免疫评分者有更高的复发或死亡风险；在结合T/N分期的多变量分析中，免疫评分仍与其DFS独立相关。该研究还发现免疫评分可指导Ⅲ结肠癌患者辅助化疗疗程，即相比于3个月疗程，只有中、高IS者可从6个月mFOLFOX治疗中获益。另一项前瞻性临床试验显示，600例接受术后mFOLFOX化疗的Ⅲ期结肠癌患者进行免疫评分检测，其高、低免疫评分者3年DFS分别为92%、78%[16]，与IDEA队列研究一致。由此可见免疫评分可以优化Ⅲ期结肠癌患者的辅助治疗决策。YOMODA等[20]也发现，高免疫评分的Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者具有较好预后，且免疫评分是OS和无复发生存率(RFS)的独立预后因素。

4 免疫评分的探索

4.1预测其他疾病的预后 作为一个基于免疫功能的生物标记物，免疫评分具有可行性、简单性和重复性等特点[21]。目前，免疫评分系统已在多种实体肿瘤的预后评估中取得进展[22]，包括黑色素瘤、胰腺癌[23]、膀胱癌[24]等。免疫反应作为机体应对各种刺激的一种防御反应，可以影响多种疾病的进展，包括肿瘤及非肿瘤性疾病。一项关于免疫评分预测非肿瘤性疾病生存时间的研究正在进行中，该研究指向高免疫细胞浸润与更长的生存时间有关[22]。若其结果得到进一步验证，免疫评分将广泛应用于临床为患者带来获益。

4.2预测抗肿瘤治疗疗效 免疫评分系统可用于预测多种抗肿瘤常规疗法和新疗法的治疗疗效。有研究发现，蒽环类、铂类化疗药物及电离辐射通过激活机体免疫反应以达到最佳抗肿瘤治疗效果[17]；直肠癌和乳腺癌良好的新辅助放化疗疗效与肿瘤内高CD3+、CD8+T细胞浸润密切相关[25-26]。

近年来，免疫治疗是抗肿瘤治疗领域取得的最重大突破，成为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后又一全新抗肿瘤治疗方法，在治疗多种晚期恶性肿瘤中获得引人注目的临床疗效，主要包括T淋巴细胞过继疗法、肿瘤疫苗及免疫检查点抑制剂等。其中，针对程序性死亡受体1(PD-1)及其配体(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的免疫检查点抑制剂已经广泛地应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种实体肿瘤的一线或后线治疗，为患者带来长期生存获益。然而其客观有效率仅为10%～30%[27]，并且部分患者出现明显不良反应[28]。因此，准确预测免疫治疗疗效、筛选适宜患者是一个重要的环节。目前，最常用的预测指标主要是PD-1/PD-L1表达状态、微卫星不稳定性或错配修复功能状态。CHEN等[29]对接受抗CTLA-4序贯抗PD-1治疗的患者进行研究发现，抗CTLA-4治疗早期及序贯抗PD-1治疗早期应答者的CD3+、CD8+T细胞密度高于无应答者，且治疗过程中应答者CD8表达水平明显提高。因此，治疗早期评估肿瘤组织的免疫状态具有更高的预后价值。有研究发现，黑色素瘤、结直肠癌等多种恶性肿瘤治疗前组织活检中CD8+、CD4+、PD-1+细胞浸润密度与其治疗反应密切相关[30-31]，并且预测Pembrolizumab治疗Ⅲ期黑色素疗效的最佳指标不是PD-1、PD-L1，而是肿瘤中心和IM中CD8+T细胞浸润密度。其中，肿瘤内高CD8+T细胞浸润是抗PD-1单抗激活抗肿瘤免疫反应的重要基础。总之，免疫评分亦可作为一种预测抗肿瘤治疗疗效的标记物。

4.3结合其他指标或技术的探索 由于免疫组化可用型标记物的限制，CD3、CD8+T细胞浸润密度未必能全面反映肿瘤局部免疫状况。并且针对不同区域、不同种族人群可能需要结合TNM分期、MSI状态等指标以完善该评分系统[32]。新西兰的一项研究表明，将B淋巴细胞诱导蛋白-1纳入免疫评分可进一步识别高危患者[33]。除了免疫因素外，肿瘤基质密度、间质区域面积等内在因素也具有重要的预后价值。REICHLING等[34]研发了一可以同时检测上述因素的人工智能软件。通过该软件对肿瘤中心和IM中CD3+、CD8+T细胞密度进行评估，结果显示，标准免疫评分预测RFS的能力未明显优于单独的肿瘤中心CD3+T细胞密度，而后者与肿瘤基质密度等相结合后明显优于前者。JAN等[35]通过研究发现，与健康人相比，Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者血管内皮生长因子、血浆转化因子B1等抑制因子水平明显升高，而CD8+T、CD4+T细胞和自然杀伤细胞等明显减少。可进一步将其与免疫评分进行比较以探索循环免疫状态与肿瘤局部免疫状态之间的相关性，从而明确循环免疫状态是否可以作为评估肿瘤预后、筛选高危患者的新工具[36]。将免疫评分与其他具有预后价值的指标或技术相结合，有望进一步提高肿瘤患者预后评估的准确性。

5 小结与展望

免疫评分评分系统是可重复的、稳定的，其在预测结肠癌患者预后、筛选高复发风险人群等方面具有重要价值。目前，免疫评分已被正式纳入世界卫生组织《消化系统肿瘤(第5版)》和2020年欧洲临床肿瘤协会指南，并且已被引入我国。推荐Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者进行免疫评分检测，以辅助临床医生评估术后复发风险，指导治疗决策的制定，但是目前尚未明确其二分类和三分类系统的优缺点。因此，该评分系统的标准尚待进一步细化。