肿瘤微环境在肿瘤血管生成的研究进展

肖剑波，钟佳宁，陈 斌

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室；3.赣南医学院第一附属医院普外科，江西 赣州 341000）

肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）最早由IOANNIDES 和WHITESIDE［1］提出，在肿瘤血管生成起着关键作用，而肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的关键环节。TME 主要由肿瘤细胞、细胞外基质蛋白（Extracellular matrix，ECM）、血管、成纤维细胞、免疫细胞、淋巴细胞、内皮细胞（Endothelial cells，ECs）、神经和细胞因子组成［2］。有文献报道在没有肿瘤血管生成的情况下，肿瘤生长直径不会超过2 mm［3］。虽然一代和二代抗肿瘤血管靶向药物已投入临床应用，然而我们发现单独阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）对某些癌症患者没有明显的益处。这给我们启示，肿瘤血管生成不是简单的分子信号通路串联总和，可能是多通路广泛联系、相互影响的生物事件综合效应。随着研究进展，我们越来越关注将肿瘤作为一个生态环境来探讨包括肿瘤血管生成在内的生物事件。

1 肿瘤微环境特点

在各种致癌诱因下，肿瘤细胞获得持续增殖和抗凋亡的能力并不断生长，肿瘤快速生长而血管生成滞后及血管功能异常，常导致肿瘤缺氧。缺氧是公认的TME 特点，在低氧环境下作为广谱转录因子HIFα 在胞质稳定性增加，最终转运至胞核与HIFβ结合，增加包括促血管生成因子在内的众多靶基因转录和蛋白质的表达［4］。这些靶基因的表达改变了肿瘤代谢方式与分泌谱，其中最为经典的是有氧糖酵解，使TME 呈低氧、酸性、高渗特点；TME 中基因谱表达的改变产生了不同于正常组织的趋化因子，招募大量骨髓和邻近组织来源的干细胞及免疫细胞并对其进行选择性分化，加重肿瘤炎性改变和免疫耐受。上述过程导致血管生成抑制因子下调，促血管生成因子表达增加，打开血管生成“开关”，启动血管生成。不断演进的TME 反过来又对各种细胞产生深远的影响，包括遗传改变和表观修饰及分子表达调节，形成更加有利于肿瘤进展的炎性、免疫耐受和药物屏障等局部环境，在所有肿瘤成员细胞的“努力”下，肿瘤血管快速畸形生成。然而，低氧和酸性等“恶劣”环境也对肿瘤细胞有害，从而对肿瘤细胞进行“优势选择”，经过选择的肿瘤细胞更具恶性表型，使肿瘤侵袭力和转移风险进一步增加。

2 癌细胞刺激血管生成

癌细胞在TME 处于核心地位，是肿瘤缺氧的始动者，直接或间接参与肿瘤血管生成。在缺氧条件下，缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor，HIF）直接上调血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）［5］、血管内皮生长因子受体（VEGFR1/2）［6］、血管生成素（Angiopoietin-1/2，Ang1/2）［7］，血小板源性生长因子-B（PDGF-B）［8］，血管生成素受体（Tie-2）［9］以及基质金属蛋白酶（MMP）［10］等促血管生成因子基因表达。MARJON PL 等［11］在培养细胞时观察到，当周围环境的氧水平从21%降低到0.3%时，VEGF mRNA 水平增加了约10至50倍。在人多形性胶质母细胞瘤中，坏死和缺乏血管的焦化区VEGF mRNA 表达最高。癌细胞间接诱导血管生成主要通过对招募细胞进行极化形成肿瘤相关间质细胞，促进促血管生成因子的表达。当然，除了缺氧，某些癌基因、抑癌基因也会直接影响HIF 的表达或者活性调控，例如：野生型P53蛋白参与抑制HIF-1 的活性调节而P53 基因突变或缺失导致HIF-1增加［12］；抑癌基因PTEN 失活会通过PI3K/Akt途径增加HIF稳定性，而PTEN的恢复又会抑制HIF 的表达［13］。HIF 的表达或稳定性增加，HIF依赖的促血管生成因子表达也增加，作为VEGF 的受体，VEGFR 除了在血管内皮表达，也在间质细胞及肿瘤细胞表达，从而形成了更加复杂的血管生成调控网络。VEGF/VEGFR 结合使受体二聚化，从而激活受体和下游PI3K-Akt、PLC-ERK 等信号级联［14］。实验表明，VEGFR-1 阻断抗体可阻止人脐血管内皮细胞（HUVECs）对VEGF-A 迁移但不影响其增殖，提示VEGFR-1 主要参与了内皮细胞迁移［15］，VEGFR-1 还参与单核-巨噬细胞和造血干细胞招募，与TME的重建相关。VEGR2是一个高亲和力受体，是参与肿瘤相关血管有丝分裂、趋化和血管通透性作用的主要受体。有实验报道VEGF-A 激活VEGFR-2导致整合素的PI3K/Akt依赖性激活，导致细胞粘附和迁移增强，这种与整合素的协同作用是VEGFR-2产生信号所必需的［16］。

3 间质细胞参与肿瘤血管生成

肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibro‑blasts，CAFs）是最丰富的肿瘤间质细胞，OLUMI 等首次证明肿瘤相关成纤维细胞促进前列腺癌生长［17］，后来相继在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤证明与肿瘤进展和血管生成相关。成纤维细胞除了直接产生VEGF外，更重要的是分泌基质细胞衍生因子1（SDF-1/CXCL12），CXCL12 通过肿瘤细胞CXCR4 受体刺激肿瘤细胞的生长，并将内皮祖细胞募集到TME［18］和直接趋化血管内皮细胞［19］，促进血管生成。此外CXCL12 能诱导内皮细胞表达VEGF-A 通过自分泌促进血管生成［20］。肿瘤相关的免疫细胞是肿瘤微环境最复杂的间质细胞群，引起肿瘤微环境呈慢性炎性和免疫耐受特点，对肿瘤血管生成等肿瘤进展的关键环节具有重大贡献。实验表明肿瘤相关巨噬细胞（TEMs）与肿瘤血管生成密切相关［21］，且TEMs 功能缺失抑制血管生成和肿瘤生长［22］。在肿瘤进展过程中，TMEs 产生TFGβ、TNFα、IL-1α、花生四烯酸等细胞因子，诱导肿瘤细胞表达IL-8 和VEGF-A，诱导血管生成［23］。近年来发现肥大细胞在肿瘤血管生成也起着重大作用，肥大细胞c-Kit受体激活后分泌类胰蛋白酶激活PAR-2 受体，启动非经典促血管生成途径［24］。在粘液纤维肉瘤患者中，中性粒细胞数量增加与肿瘤微血管密度（MVD）增加相关［25］，研究发现在ras癌基因驱动的肿瘤进展模型中，肿瘤相关的中性粒细胞（TANs）介导IL-8等炎性介质表达诱导血管生成［26］，此外中性粒细胞还通过分泌MMPs 等蛋白酶或调节其活性诱导血管生成［23］。目前对骨髓来源内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells ，EPCs）在肿瘤相关血管生成的作用存在争议，有研究显示EPCs在肿瘤组织内血管形成的参与程度高于一般肉芽组织。有文献报道EPCs可以占肿瘤脉管系统的50%～100%［27-28］，而另一些文献表明肿瘤血管内皮很少检测到EPCs［29-30］，另外，有文献指出，EPCs以25%～30%直接参与肿瘤早期血管生成，而4 周后EPCs 的比例降至1%［31］。在淋巴瘤和神经母细胞瘤中，观察到内皮细胞部分来源于恶性细胞［32-33］。WANG R［34］和RICCI-VITIANI L［35］等用恶性胶质瘤干细胞在体外转分化为血管内皮细胞并在体内证明其与血管生成有关。而CHENG L等的实验证明恶性胶质瘤干细胞只能转化为血管周细胞，而不能转化为血管内皮细胞［36］。血管周细胞对内皮细胞的增殖、迁移、血管形成和通透性都有关键影响，血管周细胞分泌VEGF 促进内皮细胞增生［37］，血管周细胞和平滑肌细胞均可表达Ang1和Ang2。Ang1/Tie2 介导内皮细胞存活和成熟信号，Ang2/Tie2介导内皮细胞不稳定，从而促进毛细血管出芽，形成新的血管［38］。

4 肿瘤酸性环境在肿瘤血管生成的作用

有报道指出酸性环境诱导骨髓来源的血管内皮祖细胞凋亡，抑制血管生成［39］，酸性环境通过G蛋白偶联受体-4（GPR4）激活人血管内皮细胞内质网应急通路，增加内皮细胞的死亡［40］。然而有文献报道乳酸可以通过单羧酸转运蛋白-1（MCT1）受体进入内皮细胞，通过KB/IL-8 通路促进肿瘤血管生成［41］，内皮细胞中乳酸在常氧条件下也能促进血管生成［42］。有趣的是，乳酸诱导的VEGF 表达需要酸性pH，然而仅酸性pH 不能稳定HIF-1α，肿瘤表达VEGF 减弱［41］。胞外酸性环境更多是通过癌细胞、间质细胞和基质理化性质的改变间接促进血管生成。有研究发现胞外低pH 通过胞外信号激酶、P38丝裂原活化蛋白激酶、NF-κB 信号通路激活间充质干细胞，分泌促血管生成物CXCL8［43］。酸性细胞外环境也通过ERK1/2 MAPK 信号通路诱导人胶质母细胞瘤细胞VEGF 表达［44］。酸性环境还能够诱导肿瘤细胞或间质细胞MMP9、PDGF、VEGF、IL-8 等促血管生成基因的表达。此外，酸性环境能够增加MMP9/2等蛋白酶活性，从而促进血管生成。

5 神经系统对肿瘤血管生成的作用

神经在肿瘤中的作用一直被忽视，现在越来越多的证据表明神经在肿瘤血管生成方面具有不可或缺的作用。神经系统与前列腺癌［45］、胃癌［46］、胰腺癌［47］、乳腺癌［48］、卵巢癌［49］等相关。有研究发现脊髓损伤患者前列腺癌发病率较低［50］。FAULKNER S 等研究表明，肿瘤侵袭和转移与TME中神经密度相关［51］。ZAHALKA一项研究表明，肿瘤交感神经释放去甲肾上腺素通过血管内皮受体促进肿瘤血管生成［45］，这与之前报道交感神经系统的激活可以刺激癌症的发展吻合［52］。有研究表明，β受体阻滞剂对黑色素瘤［53］、非小细胞肺癌［54］、乳腺癌［55］、卵巢癌［56］及多发性骨髓瘤［57］进展有积极影响。一个简单事实：癌症相关的疼痛能为大脑皮层所感受，表明肿瘤微环境与大脑皮层相关。有文献报道压力［58］和社会条件［59］可以促进肿瘤进展和转移，压力可能通过肿瘤微环境内交感神经的激活直接刺激血管生成［45］。应激释放的儿茶酚胺可激活卵巢癌细胞上肾上腺素β2受体（ADRB2），使VEGF基因表达增加，使肿瘤血管化增强［60］，也有报道社会压力通过肿瘤细胞β 受体上调炎性基因的表达［61］，从而促进肿瘤血管生成。此外，神经系统与肿瘤间质细胞尤其是免疫细胞关系密切，在肿瘤进展和转移起重要作用［62-63］。

6 外泌体/囊泡对肿瘤血管生成的作用

外泌体来源于细胞的脂质双层膜泡，大小约30～100 nm［64］，内含各种非编码RNA、DNA、蛋白质、脂类等物质［65］，主要携带亲代细胞的各种生物信息，并在受体细胞中诱导多种信号反应。外泌体在多种肿瘤TME 中分泌增加并广泛参与肿瘤血管生成，乳腺癌细胞的胞外囊泡携带的VEGF 激活内皮细胞VEGFR促进肿瘤血管生成［66］，神经胶质瘤的外泌体富含Dll-4，抑制内皮细胞内Notch 信号传导，增加肿瘤血管密度［67］，在结直肠癌中，肿瘤来源外泌体囊泡中miR-9 通过抑制内皮细胞SOCS5 的表达，促进内皮细胞的迁移和血管生成作用［64］。外泌体也是肿瘤酸性环境的主要贡献者［68］，而低氧和酸性环境反过来又诱导外泌体分泌增加，且酸性环境增加受体细胞融合外泌体的能力，有利于肿瘤血管生成效能［69-70］。实验表明，缺氧诱导癌细胞富含miR210的外泌体分泌，转运至内皮细胞，抑制Ephrin A3和PTP1B的表达，促进肿瘤血管生成［71］。来源于缺氧肺癌外泌体的miR23a，转运至内皮细胞抑制PHD1/PHD2和ZO-1，导致HIF 在胞内稳定性增加，增加肿瘤血管生成和血管通透性［72］。事实上从缺氧肿瘤细胞分离出的囊泡在体内外促进血管生成和肿瘤生长的作用比常氧情况下更强［72］。也有报道证明间充质干细胞外泌体的miRNA 对血管生成起着广泛作用［73］，癌细胞来源的外泌体还可作用于间质细胞间接促进肿瘤相关血管生成。有文献报道黑色素瘤细胞分泌的外泌体miR155-5p作用于肿瘤相关的成纤维细胞，靶向抑制SOCS1，从而下调JAK2/STAT3信号通路和增加VEGFα、FGF2、MMP9 等促血管生成因子的表达［74］。施晓雷等研究发现肝癌细胞来源的外泌体miR-21转入造血干细胞，下调其靶蛋白PTEN 而激活PDK1/Akt 信号通路，将造血干细胞转化为CAFs，促血管生成因子IL-6 和IL-8 分泌而增加，加速肿瘤进展［75］。当然，肿瘤相关的成纤维细胞外泌体也能反作用影响肿瘤细胞［76-77］，在这里不再概述，但不得不强调，肿瘤相关成纤维细胞的外泌体参与肿瘤细胞的上皮间质转化［78］，而上皮间质转换后的肿瘤细胞分泌的外泌体更具有促进肿瘤血管生成的能力［79］。目前尚未见文献报道肿瘤相关的免疫细胞外泌体直接参与血管内皮调节，但我们观察到肿瘤来源的外泌体可以调节巨噬细胞的M2/PD1+极化［80-81］，极化的巨噬细胞能促进血管生成。肿瘤分泌的miR-21和miR-29a在肿瘤免疫细胞中作为配体直接与toll 样受体（TLR）家族的受体结合，从而触发TLR 介导的炎症反应［82］，而肿瘤的炎症环境有利于肿瘤血管生成。目前关于内皮细胞的外泌体通过旁分泌或自分泌促进血管的生成尚未见报道。

7 结论与展望

肿瘤发生、发展、转移及复发等多种过程离不开肿瘤血管生成，而肿瘤血管生成是TME 中所有细胞共同作用的结果。尽管TME 对肿瘤血管生成的的研究取得了不少的成果，但就目前而言，更加深入的信号关联及作用机制并把这些策略转化为临床实践还是一个巨大的挑战。未来，我们在TME 对肿瘤血管生成的研究重点依然在TME 的网络信号调节，关键在炎性和免疫方向，从而对TME 中细胞和分子在治疗血管生成的作用进行精确评估，为抗肿瘤血管靶向治疗提供精准方案。