miR-34a在骨肉瘤患者血清中的表达及在诊断和预后中的价值

骆浪，何伟，张磊

(湖北省汉川市人民医院骨科，湖北 汉川 432300)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一种多发于青少年的高度恶性肿瘤，约占原发性骨肿瘤的20%[1]。OS患者临床表现具有生长快、病程短、易早期发生转移等特点，导致OS患者的生存率比较低。随着OS切除手术以及辅助放化疗技术的提高，OS患者的生存率得到一定改善，但因缺乏早期敏感与特异性的诊断标记物，使得OS患者一旦发现多已发展到疾病的晚期，导致其复发率与死亡率仍居高不下，据报道晚期OS患者5年生存率仅为20%～30%[2]。因此，积极寻找OS患者高敏感度、高特异性的早期诊断标记物就显得尤为重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是长度为18～25个碱基序列的内源性非编码小分子单链RNA，其表达量与肿瘤的发生、发展密切相关[3-4]。近年来，研究表明外周血miRNA在OS患者的早期诊断、准确诊断以及微创诊断中具有重要作用[5]。miR-34a作为miRNA家族中的一员，属于肿瘤家族中常见的抑癌基因。有报道miR-34a在OS患者组织中表达明显降低[6]，且在体外具有抑制OS细胞快速增殖和转移的作用[7-8]，但是否在OS患者外周血中表达发生变化还未见相关报道。本研究通过RT-qPCR检测OS患者外周血中miR-34a表达的变化，分析其表达与患者临床病理特征以及生存率的关系，探讨其在OS患者中的诊断及预后的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性分析湖北省汉川市人民医院2008年1月至2014年1月收治的OS患者54例，其中男23例，女31例；年龄10～30岁，平均(15.6±2.3)岁。肿瘤发生于股骨远端21例，胫骨近端28例，肱骨5例。纳入标准：入院前未经任何治疗；组织病理诊断确诊为OS；无其他肿瘤。排除标准：入院前已经接受手术或放化疗治疗；临床资料不完整；合并其他肿瘤；无自主行为能力。参考《骨肉瘤临床循证诊疗指南》对所有骨肉瘤患者采取治疗，同分期患者治疗方法无差异。患者出院后，通过电话和复诊的方式对患者进行随访，随访截止时间为2019年4月，总生存时间指患者自第一次治疗到卒于该肿瘤的时间(生存者按最后随访时间算)。所有患者及家属签署知情同意书并自愿配合本实验研究。选择同期健康体检者54例作为正常对照，其中男25例，女29例；年龄10～30岁，平均(16.3±2.1)岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本实验研究已获得汉川市人民医院伦理委员会同意。

1.2 检测方法

1.2.1 标本制备 晨起收集所有检测者静脉血10 mL，血样采集后立即放置于无DNA酶和RNA酶的灭菌采血真空管内，自然放置，1 000 g/min，离心5 min，收集血清，将最终获得的血清置于无RNA酶的Ep管中-80℃保存、备用。

1.2.2 RT-qPCR检测血清miR-34a 利用TRizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)提取血浆总RNA，使用紫外分光光度计鉴定RNA，参照反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)生成cDNA，反应条件：65℃ 10 min；25℃ 6 min；冰浴2～5 min；45℃ 30 min；70℃ 10 min。反应产物保存于-20℃下备用。以cDNA为模板通过qPCR扩增，扩增条件：96℃ 18 s；60℃ 20 s；75℃ 15 s，共40个循环。选取U6为内参，所有检测结果均采用2-ΔCt的方法进行分析。反应中所使用的引物委托宝生物工程有限公司设计合成，其具体序列设计见表1。

2 结 果

2.1 OS患者与健康体检者血清miR-34a表达的比较 与健康体检者血清miR-34a表达量(2.21±0.97)相比，OS患者血清miR-34a表达水平(1.17±0.91)明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 血清miR-34a表达对OS的诊断价值 通过ROC评估血清miR-34a是否能够作为OS诊断的标志物，研究结果发现：曲线下面积(area under curve，AUC)为0.830(95%CI=0.751～0.908，P<0.01)；根据约登指数(cut-off)确定诊断OS的miR-34a临界阈值即截断值为1.34，其诊断OS的灵敏度为79.6%、特异性是75.9%(见图1)。

表1 miR-34a以及内参U6引物序列

图1 血清miR-34a表达的ROC曲线

2.3 OS患者血清miR-34a表达与临床病理参数的关系 以中位值0.87为分界点，将OS患者分为血清miR-34a高表达23例和血清miR-34a低表达31例。通过χ2检验发现，血清miR-34a表达与肿瘤大小、TNM分期以及是否转移有关(P<0.05)，与性别、年龄和肿瘤位置无关(P>0.05，见表2)。将血清miR-34a作为因变量，肿瘤大小、TNM分期以及是否转移作为自变量，进行Logistic回归分析，结果表明肿瘤是否转移(P=0.001，OR=0.018)、TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影响miR-34a表达的独立因素。

表2 单因素分析OS患者血清miR-34a表达与临床病理特征的关系

2.4 miR-34a表达对OS患者生存率的影响 通过Kaplan-Meier法和log-rank检验发现，miR-34a低表达OS患者总生存率明显低于miR-34a高表达患者，差异具有统计学意义(P=0.003，见图2)。

图2 miR-34a表达对OS患者总生存率的影响

3 讨 论

OS是一种起源于间叶组织的原发性骨肿瘤，恶性程度非常高。早期如果采取手术联合放化疗治疗，其5年生存率接近50%～70%[9]；一旦没有早期诊断发现，导致其发生转移，其预后会很差，5年生存率仅为10%[10]。因此，早期发现并诊断OS对其治疗和预后就显得非常重要。OS现阶段诊断主要依靠临床表现的特点以及影像学检查，但确诊还是依赖于病理检查观察到的肿瘤细胞形成的骨样组织[11]。很多OS患者早期临床表现和影像学检查并不明显，因此单纯的临床表现和影像学检查误诊率高且容易延迟诊断；病理检查虽然是OS诊断的金标准，但具有创伤性，操作也不方便。因此，临床上急需寻找到一种早期的、高效的、高敏感度的OS诊断标志物。

miRNA为小非编码RNA基因产物，在许多肿瘤中出现差异性表达，因此miRNA的表达分析已经成为肿瘤诊断、治疗以及预后判断的重要生物学标志物[12]。miR-34a为miR-34家族中的一员，通常作为一种抑癌miRNA发挥作用，其基因序列位于染色体lp36上，受到经典的抑癌因子P53调控，影响细胞的衰老、凋亡、增殖等[13]。另外，有研究报道miR-34a可以通过下调CDK4、CDK6、E2F3、E2F5、c-Met等基因的表达，发挥其肿瘤抑制的作用[14-16]。因此，在众多恶性肿瘤中miR-34a表达减少或缺失，如金玲玲等[17]报道在宫颈癌患者血清中miR-34a-5p表达量降低，且在宫颈癌的发生发展过程中起抑制作用；岳会珠等[18]报道乳腺癌组织中miR-34a低表达，并且与患者肿瘤分期、浸润深度、是否淋巴结转移以及不良预后有关；李颖等[19]报道肝癌组织中miR-34a表达明显低于正常肝组织，且肿瘤的恶性程度越高miR-34a的表达就越低。然而，关于miR-34a在OS患者血清中的表达水平以及与OS患者临床病理特征及生存关系尚未见报道。

血清和血浆中miRNAs检测正发展成为一类新的潜在生化标志物，用于非侵入性诊断和监测癌症的发生、发展和预后[20]。相比肿瘤组织标本来讲，血标本更易获取，对人体的伤害较小，并且miRNA在血标本中稳定表达、敏感性和特异性高。因此，血标本中差异表达的miRNA有利于肿瘤的早期诊断、筛查以及指导治疗。任慧文等[21]通过骨肉瘤血样研究提示258个差异表达基因，其中miR99b-5p/miR124表达比可以作为诊断骨肉瘤的生物标志物；马草源等[22]报道骨肉瘤组织与外周血在miRNA表达上存在相关性和一致性，其中miR-21与miR-29表达的特异性最明显，可以作为骨肉瘤早期诊断的生物学标志物。本研究通过检测OS患者血清miR-34a表达，结果发现miR-34a表达水平明显低于健康者(P<0.01)，说明miR-34a在OS患者血清中呈现低表达，提示miR-34a可能作为抑癌基因参与到OS的发生中，与其在其他肿瘤中的作用相似。ROC曲线是一种常见的评估诊断效能的方法，理想情况下AUC为1.0，此时特异性与敏感性皆为100%；当AUC越接近1.0时诊断效能越高、预测越准[23]。本实验研究发现通过ROC曲线对血清miR-34a诊断价值进行评估时，AUC为0.830，当诊断OS的miR-34a截断值为1.34时，其诊断骨肉瘤的灵敏度为79.6%、特异性是75.9%，说明血清miR-34a表达水平是诊断骨肉瘤的潜在生物标志物，具有较高的灵敏性和特异性。单因素与多因素分析血清miR-34a表达水平与临床病理参数的关系，发现miR-34a表达与肿瘤大小、TNM分期以及是否转移有关(P<0.05)，而与性别、年龄和肿瘤位置无关(P>0.05)，且肿瘤是否转移(P=0.001，OR=0.018)和TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影响miR-34a表达的独立因素，表明肿瘤发生转移或分期越高，miR-34a表达越低，预后越差；反之预后越好。本研究成果对于OS外周血差异表达基因谱的建立以及OS早期诊断、靶向治疗和预后的评估等具有非常重要的意义。但本实验仅局限于本院OS患者，样本数量比较少，因此仍需要做大样本的随机实验研究；且miR-34a在OS中的具体作用机制还不清楚，有待于后续实验的进一步研究。

综上所述，血清miR-34a水平可作为OS早期诊断、病情进展及预后评估的生物学指标，并有望为OS患者的治疗提供新靶点，值得临床推广应用。