羊肠道益生芽孢细菌的筛选及D-4-1菌株胃肠道耐受

武君霞,刘 泽，杨辰涛,韩 燕,柏凤伟,李 雄,刘思春,郝庆红,吴国江,刘月琴,郭云霞*

(1. 河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001；2. 保定市畜牧工作站, 河北 保定 071051；3. 河北农业大学 动物科技学院， 河北 保定 071001)

近年来有关于超级耐药菌的报道逐渐增多，而产生超级耐药菌的主要原因在于抗生素的滥用。畜牧养殖中滥用抗生素导致畜禽体内残留进而转嫁给人类，导致人类耐药菌的出现，致使抗生素的药效减弱甚至无效。世界上许多国家相继颁发了一系列法律法规，禁止或限制饲料中抗生素的使用。2006年1月，欧盟全面禁止抗生素用作饲料添加剂，提出了微生态制剂在动物营养中的应用的安全性[1]。2019年，中华人民共和国农业农村部发布了第194号公告[2]，促生长药物饲料添加剂在2020年7月1日后全部退出，绿色、环保、健康、高效的养殖新体系逐渐成为养殖业的趋势。研究无残留、无耐药性的饲用添加剂如抗菌肽[3]、微生态制剂及其发酵产物等[4]成为新形势下养殖业的焦点。目前，我国也已全面启动和实施无毒、无公害的微生态饲料添加剂工程，这为微生态制剂替代抗生素应用提供了广阔的前景。

益生菌通过在动物黏膜、皮肤等表面定植或者产生功能性的酶，在细胞间形成生物屏障，以降低病原菌的侵染和定植[5]，同时也产生宿主所需的营养物质，如氨基酸、维生素、微量元素、生长因子等[6]，还可通过激活巨噬细胞、增强NK细胞活性、提高细胞因子及免疫球蛋白的含量促进特异性免疫和非特异性免疫反应[7]。通过补充、调整和维持动物肠道微生态平衡，改善肠道菌群紊乱，从而减少细菌、病毒等引起的感染性腹泻与非感染性腹泻，进而达到防病治病的目的[8]。但目前可用于不同畜种专属的微生态制剂较少，同时市售产品菌种活性不稳定，因而，筛选优良动物源益生菌菌株，开发绿色安全饲用益生菌制剂，推动畜牧业健康、快速发展具有重要的现实意义。本研究本着同源性的原则，由动物肠道中筛选出对腹泻有明显缓解或治疗效果的益生菌，为益生菌剂在动物生产上的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 大肠杆菌(E.coli)指示菌，由河北农业大学制药工程系实验室保存。

1.1.2 样品 取健康羊的肠道内容物，混合后冷藏备用。

1.1.3 试剂 0.5%的番红水溶液、孔雀绿染色液、接触酶试验试剂、甲基红试剂、乙酸铅纸条、10%三氯化铁水溶液、1%琼脂糖凝胶、TAE缓冲液等。

人工胃液配制：9.5%～10.5%的盐酸16.4 mL，加水稀释，使pH分别达到2.0、3.0、4.0；每100 mL液体中加入1.0 g胃蛋白酶，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

人工肠液配制：取KH2PO46.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调pH至7.5，加水稀释至1 000 mL，每100 mL液体中加入1.0 g胰蛋白酶，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 细菌用培养基

琼脂培养基(NA)：琼脂20 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，溶到1 000 mL蒸馏水中。调pH到7.2～7.4。

种子培养基(NB)：NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，溶到1 000 mL蒸馏水中。调pH到7.2～7.4。

发酵培养基：配方同NB一样。

1.1.4.2 生理生化试验鉴定用培养基

根据系统发育树结果，选择相近的标准菌株进行V-P、M.R等生理生化试验。生理生化试验用培养基见伯杰细菌鉴定手册(第8版)[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的采集与处理 将新鲜的羊肠道用无菌剪刀从中间剖开，用无菌的载玻片刮取肠道内含物于无菌烧杯中，再轻轻刮取肠粘膜壁一并放入烧杯，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀后，采用五点取样法取大约1 g左右内容物，放入含有99 mL无菌水的试管中，37 ℃、150 r/min振摇30 min，分散菌群。取出菌样，梯度稀释，从中取3个稀释梯度(10-4、10-5、10-6)的菌悬液进行涂布，每个稀释度涂布3个平板，置于37 ℃培养箱倒置培养24 h，得到单菌落。挑取形态有差异的单个菌落做划线接种，编号，置于37 ℃培养箱恒温培养24 h。放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌株的筛选

1.2.2.1 病原菌平板的制备 将大肠杆菌转入50 mL的NB培养基中，37 ℃、150 r/min恒温摇床震荡培养过夜，得到菌悬液，然后用UV法，在λ为600 nm下测定其OD值，调整菌液OD值为0.6。吸取1 mL菌悬液转入已冷却至40～45 ℃的100 mL NA培养基中，迅速混合均匀，立即倒平板，每个平板大约15 mL，冷却，备用。

1.2.2.2 初筛 从划线接种的斜面上用竹签轻轻刮取菌体，在病原菌平板上划十字，每个病原菌平板平均分成4部分，在病原板的背面做好标记，每个菌划一个十字，平板上的编号要与斜面上菌的编号一一对应。37 ℃培养24 h，记录抑菌圈的大小，然后选取较大抑菌圈的菌株，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2.3 复筛 从初筛结果中挑取抑菌圈较大较优良的菌株进行复筛。将挑选出的菌株转接到NA培养基斜面上，置于37 ℃培养箱恒温培养24 h活化菌株。将活化后的菌株转接到发酵液体培养基中，37 ℃恒温摇床培养18～24 h，获得发酵液，用UV法测定其OD值。在病原菌平板上打孔，加入80 μL菌悬液，每个菌样有3个平行，置于37 ℃培养箱中恒温培养24 h，观察、记录抑菌圈直径。

1.2.3 芽孢菌D-4-1菌株的鉴定

1.2.3.1 形态学观察 将分离得到的D-4-1菌株进行菌落形态、菌体观察，革兰氏染色、芽孢染色等参考《微生物学实验》进行[10]。

1.2.3.2 分子生物学鉴定 取抑菌圈最大的D-4-1菌株对数生长期发酵液(摇床培养12 h)750 μL至EP管中，4 ℃，8 500 r/min离心7 min，重复3次。用无菌水洗涤沉淀2次，除去残留的发酵液，4 ℃、8 500 r/min离心7 min。据参考文献[11]进行菌株DNA提取及PCR反应，以细菌的16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTGTTACGACTT)引物进行16S rDNA序列扩增[11]。PCR产物送到北京生工生物技术进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST功能进行同源性分析，选取同源性较高的菌株序列，利用MEGA.7软件进行多序列比对，构建系统发育树。

1.2.3.3 生理生化试验 据16S rDNA的分析结果，依据《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]，对照芽孢杆菌分类学[9]，对芽孢菌株进行生理生化试验，并记录结果。

1.2.4 芽孢杆菌D-4-1菌株耐受试验

1.2.4.1 胆酸盐耐受试验 将D-4-1菌株接种到牛胆盐浓度分别为0.0%、0.1%、0.2%、0.3%的NB培养基中，37 ℃培养24 h，然后梯度稀释，取10-4梯度刮板计数。取0.1 mL涂平板，平板计数存活情况。

1.2.4.2 人工胃液耐受 将活化好的芽孢杆菌按1.0%的接种量接入到上述人工胃液中，稀释到10-6，取100 μL加入到平板上，涂布后在37 ℃培养箱中陪养24 h，进行活菌平板菌落计数。

1.2.4.3 人工肠液耐受 将活化好的芽孢杆菌按1.0%的接种量接入到上述人工肠液，37 ℃，180 r/min摇床培养，在0 h、2 h、4 h、6 h进行活菌平板菌落计数。稀释到10-6，取100 μL加入到平板上。

1.3 数据处理

数据经EXCEL处理后用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 初筛

图1为部分菌株初筛结果。经病原菌拮抗试验，从羊肠道中初筛得到180株菌，其中抑菌圈大于9 mm的有120株。

图1 初筛抑菌圈Fig.1 Initial screening zone

2.2 复筛

图2为部分菌株复筛结果。从180株初筛菌株中选取80株不同形态的活性较高的菌株进行复筛，共分离得到具有较高拮抗作用的菌株6株，其抑菌圈直径均大于13 mm。其中L-2-11菌株和D-4-1菌株抑菌圈直径分别为18.0 mm和18.7 mm，抑菌效果显著高于其他菌株(P<0.05)(表1)。

图2 复筛抑菌圈Fig.2 Rescreening inhibition zone

2.3 形态学观察

由图3可知，D-4-1菌株为类透明色大菌落，椭球形，边缘光滑，不凸起，湿润。菌体呈杆状，革兰氏染色阳性(G+)，菌体长约1.4 μm，宽约0.5 μm，散在或成对排列。由图4可知，D-4-1菌株产芽孢，且芽孢中生，呈椭圆形，长约0.6 μm，宽约0.3 μm。

表1 复筛抑菌试验结果Table 1 The results of secondary screening bacteriostasis test

图3 D-4-1菌体形态Fig.3 Mycelium morphology of D-4-1 strain

图4 D-4-1菌株芽孢染色Fig.4 Spore dyeing of D-4-1 strain

2.4 芽孢菌株D-4-1分子生物学鉴定

据测序结果，将菌株D-4-1的16SrDNA序列在NCBI上与芽孢菌株的标准菌株序列进行BLAST比对，对相似性较高的标准菌株，利用MEGA.7软件构建系统发育树，结果显示菌株D-4-1与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)处于同一分支，亲缘关系最近(图5)。初步鉴定菌株D-4-1是短小芽孢杆菌。

2.5 生理生化鉴定

据菌株D-4-1形态学特征及16 S rDNA结果进行针对性生理生化测定，结果见表2。由表2可知D-4-1接触酶、糖发酵试验等结果一致，通过对照相关文献，菌体、菌落形态及《常见细菌系统鉴定手册》[12]，判断D-4-1为芽孢杆菌属与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)生理生化特征基本一致。

2.6 芽孢杆菌D-4-1菌株的耐受试验

2.6.1 胆酸盐耐受试验 由表3可知，D-4-1在0.1%胆酸盐浓度下10-4梯度有大于300个菌落，随着胆酸盐浓度的增加，菌落数与0%胆酸盐浓度相比极显著下降(P<0.01)，但在0.3%浓度下仍然有60个菌落，表明D-4-1菌株能耐受一定浓度的胆酸盐。

2.6.2 人工胃液耐受试验 低pH的胃液是益生菌进入肠道的首要关口。通常胃酸的pH在2.0～3.0。由表4可知，在10-6稀释度下，pH 2.0的环境下有11.67个菌落存活，随着pH增加，菌落数呈波动增加，且在pH 4.0条件下达到124个菌落，极显著高于pH 2.0(P<0.01)和pH 3.0(P<0.01)，表明益生菌可通过与食糜混合后，穿越胃环境到达肠道发挥作用。

2.6.3 人工肠液耐受试验 肠道pH大约在6.0～7.0，益生菌进入动物肠道后随着时间的延长菌落数逐渐增加，在进食6 h后，10-6稀释度下，菌落数大于300个，呈极显著增加(P<0.01)，表明在动物肠道中菌株D-4-1能够很好的存活，进而发挥益生作用。

图5 菌株D-4-1的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain D-4-1

表2 生理生化鉴定试验结果Table 2 The results of physiological and biochemical experiments

表3 胆酸盐浓度对菌株D-4-1生长的影响Table 3 The growth of strain D-4-1 in different concentrations of bile salt

表4 菌株D-4-1在不同pH的人工胃液中存活情况Table 4 The growth of strain D-4-1 in different pH of gastric juice

表5 菌株D-4-1 在人工肠液不同时间的存活情况Table 5 The growth of strain D-4-1 in different time of artificial intestinal fluid

3 讨 论

肠道致病菌引起临床疾病的机制有产生毒素和入侵肠粘膜[13]。致病菌会产生多种毒素，破坏肠道上皮细胞，从而导致炎症性腹泻。与肠道致病菌进行对峙生长试验是筛选目的益生菌等微生态制剂的有效途径。本研究利用肠道病原菌为指示菌，从羊肠道中筛选出具有抑菌活性的D-4-1菌株，经代谢产物复筛得出，该菌代谢产物中含有抑菌活性物质，能发挥很好的抑菌效果。经形态学、生理生化、16 S rDNA序列分析，得出拮抗细菌D-4-1为短小芽孢杆菌。刘噶等[14]由犊牛创口分离到一株短小芽孢杆菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且上清液的抑菌作用明显。产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)为幼畜严重腹泻的重要致病菌[15]，是一种重要的能够在全球范围内引起疾病的病原，其毒力因子是黏附素、肠毒素、内毒素等，破坏肠道黏膜屏障，造成黏膜损伤，引发幼畜腹泻[16]。研究表明，益生菌代谢产物包括SCFAs(丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐等)、吲哚、细菌素和维生素等[17]。其中丁酸及其盐类等可参与维持肠道良好形态、干预肠道细胞增殖分化，调节肠道上皮紧密连接的合成，从而促进肠道修复应激损伤和成熟[18]。丙酸能通过调节细胞内pH来抑制沙门氏菌的增殖[19]。细菌素主要由革兰氏阳性菌产生，属核糖体合成的多肽发挥抗菌性能的一类物质，具有调节肠道菌群的作用，降低沙门氏菌的含量[20]。芽孢细菌是肠道内固有存在的一类严格好氧性菌或者兼性厌氧菌，它能在肠道定殖且产生多种营养物质和活性因子如分泌抗菌肽、乳酸等，有着良好的饲用价值，因而，被广泛应用于动物生产中尤其对幼畜腹泻具有显著的防治效果[21]。

胃肠道是动物的消化吸收的主要部位，肠道微生物区系的平衡对动物机体健康具有重要作用。益生菌必须耐受胃环境后再能顺利抵达肠道发挥其益生功能。众多研究表明，益生菌能够耐受一定浓度的胆酸盐和pH。张振宇等[22]通过筛选得到的益生菌在pH3.0的人工胃液中存活率为119.53%，在0.3%胆盐中生长率达到41.64%。贺珊珊等[23]由5株具有降解胆固醇的益生菌中筛选得到1株植物乳酸杆菌LP-C能够长时间耐受pH2.5的高酸性环境和0.5%的胆盐浓度。刘之园等[24]从9株益生菌中筛选得到了一株菌株，在pH1.0条件下存活率为93.69%，0.3%胆盐浓度下存活率达到88.56%。郭云霞等[11]从羊肠道筛选出一株地衣芽孢杆菌，在人工胃液、不同pH值环境及胆盐浓度下均能很好的生存。正常情况下，动物胃酸的pH在2～3之间，肠道内胆酸盐浓度0.03%～0.3%[11]。本研究体外试验证实，D-4-1菌株在0.3%的胆酸盐及pH2.0的人工胃液环境存活率较高，表明该菌可耐受胃肠道环境，在小肠发挥益生作用。

然而，动物源性益生菌的应用菌种较少且研究结果不一，但是其作为抗生素的替代品在提高家畜生产性能，提高养殖效益，促进家畜健康方面逐步得到人们的认可，这为微生态制剂在畜牧生产上的应用奠定了基础。

4 结 论

从羊肠道中筛选得到D-4-1益生芽孢菌株为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，且在人工胃肠道环境中耐受性良好。