细胞蜡块联合免疫组化技术在肺癌胸水细胞学检验中的可靠性分析

张艳胜，胡赟

肺癌属于我国发病率最高且临床最常见的一种癌症，15%的肺癌患者在就诊时已经存在胸腔积液，50%左右的患者在疾病发展过程中也会出现胸腔积液[1-2]，这时患者已经错过了最佳的手术切除时机，严重影响后期的预后。所以及早发现疾病，及时采取有效的治疗，对控制疾病发展，改善患者预后具有至关重要的作用[3]。胸水、痰液及支气管灌洗液等细胞学标本为疾病确诊的关键线索[4-5]。但是目前传统细胞学制片技术尚不完善，存在诸多的缺点，很难保障诊断的准确性[6]。为了解决这一问题，本研究以确诊肺癌患者的胸水标本为研究对象，探讨细胞蜡块联合免疫组化技术在临床诊断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2016 年2月至2019 年12 月浙江中医药大学附属湖州中医院确诊的肺癌患者116例，并收集患者的胸水标本，男76例，女40 例；年龄29 ～86 岁，平均（54.0±10.6）岁。纳入标准：（1）入院后均接受活检病理诊断确诊为肺癌；（2）签署知情同意书。排除：（1）临床资料不完整；（2）合并严重呼吸系统疾病；（3）合并严重心脑血管疾病者。

1.2 方法 对116 例胸水标本分别采用薄层液基细胞学沉降式制片技术和制备成细胞蜡块后结合免疫组化染色技术进行检查。

1.2.1 薄层液基细胞学沉降式制片 选取100 ml 的新鲜胸水标本，将其放置在专用的保存液中，匀速摇晃，确保两种液体充分混合。之后取50 ml 混合液，采用1 500 r/min 的速度离心，时间5 min，离心后去除上清液，直至约剩余2ml，摇晃均匀。把混匀的标本放入制片器中，接着将盛有混匀标本的制片器对称的放入液基细胞薄层制片机中，采用1000r/min的速度离心，时间3 min，等时间到后取出制片器，拆取玻片，待玻片稍干后将制好的玻片立即放入95%的乙醇中固定10 min。然后依染色程序，苏木素染色3 min，PBS 返蓝，水洗后放入伊红染色30s，再经由低到高的梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2 细胞蜡块联合免疫组化染色 将薄层液基细胞学沉降式制片后剩余的胸水样本添加到保存溶液中，静置在4 ℃冰箱内，直到细胞能够完全被沉淀，之后将上清液全部除掉，接着加入10 ml 95%的乙醇以2 000 r/min 的速度完成离心，离心时间5 min，静置30 min，取出沉淀物用棉纸包好放进包埋盒，在莱卡脱水机中快速处理3h后进行常规包埋，完成切片。TTF-1、CK7、CK5/6、Ki-67 抗体均购于福州迈新生物技术有限公司；采用MaxVision法对细胞蜡块进行免疫组化手工染色。把蜡块切成均匀3 m 厚度的蜡片，防脱玻片裱片，二甲苯完成脱蜡，行常规由高到低梯度乙醇水化，蒸馏水水洗后放入已煮开的新鲜配置的1∶50的EDTA液中，不锈钢锅盖不要盖紧，最小火加热20 min，时间到后，关掉电磁炉，令其自然冷却，接着蒸馏水水洗3 次，3 min/次，放入浓度为3%的H2O2中室温下孵育时间10min，PBS缓冲液冲洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加一抗TTF-1、CK7、CK5/6 及Ki-67，室温下孵育时间60 min，PBS 缓冲液冲洗3 次，3 min/次，除去PBS，切片上滴加MaxVison-HRP，室温下孵育时间15min，PBS缓冲液冲洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加新鲜配置的DAB显色试剂显色时间10min，流水冲洗终止显色，接着苏木素染色1 min，PBS 返蓝，由低到高的梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 观察指标 以活检标本病理诊断为“金标准”，对比两种不同制片方法的诊断准确率及染色效果。

1.4 统计方法 采用SPSS20.0 统计软件进行分析，计数资料采用2检验＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种不同方法制片的染色效果薄层液基细胞学沉降式制片的图像清晰度高，细胞均匀，且细胞形态良好，但是缺少一定的成团结构和腺样结构（封四彩图3）；而细胞蜡块结合免疫组化染色法的图片染色清晰度高，细胞数目多且均匀分布，而且还可以在多数切片中直观地观察到细胞具体的排列方式和结构（封四彩图4）。

图3 薄层液基细胞学沉降式制片（HE 染色，×10）

图4 细胞蜡块结合免疫组化染色制片（免疫组化染色，×10）

2.2 两种不同方法制片的诊断准确率比较 细胞蜡块结合免疫组化染色法的准确率为79.31%（92/116），高于薄层液基细胞学沉降式制片的62.07%（72/116）（2=8.32，＜0.05）；在细胞蜡块联合免疫组化诊断中，腺癌64 例、鳞癌、腺鳞癌、未分化癌及不确定类型分型中，腺癌的准确率最高（91.43%），8 例肺癌无法分型。见表1。

表1 两种不同方法制片的诊断准确率比较 例

3 讨论

本研究结果显示，采用细胞蜡块联合免疫组化染色法的诊断准确率高于薄层液基细胞学沉降式制片（＜0.05），这说明细胞蜡块与免疫组化染色法联合诊断能够有效检出细胞的具体结构，解决传统检测技术存在的缺陷和弊端，提高诊断的准确率。两种不同制片方法可以相互补充，提高诊断的准确率，实现组织学活检的目的，为医生对肿瘤组织分型、判断肿瘤的来源及对症治疗提供有力的依据[7]。对于晚期肺癌患者，体腔积液属于主要的临床表现，采用传统细胞学检查只能为医生诊断恶性肿瘤提供有力依据，无法为医生及时发现原病灶提供数据支撑，但是由于细胞蜡块组织切片能够反复、连续性的操作，而且采用细胞蜡块技术检测不会出现细胞丢失的现象，也能将少数的恶性细胞有效检出，避免出现漏诊和误诊[8-9]。

在临床诊断过程中由于受到肿块表面坏死，经气管镜下无法直接观察到肿块，难以获取组织活检标本，并且无法对组织标本的病理组织进行分型，不利于后期的诊断和治疗。采用细胞蜡块联合免疫组化染色可有效解决该难题，提高诊断的准确率，为后期治疗提供有力依据。所以在传统诊断技术的基础上联合细胞蜡块诊断法，可为及时找到原发病灶提供重要的线索；同时也可以对细胞组织进行分型，加强对分子病理的检测，为后期个性化治疗提供有力的依据。由此可见，该诊断方法在临床上具有显著的应用价值。制作细胞蜡块过程中也有几点需特别注意：（1）离心时转速应＜2 500 r/min；（2）离心管要首选漏斗状的，如果有血性的标本，要首先去除红细胞，取出细胞团块时最好采用顶针捅出的方法。

综上所述，对于肺癌胸腔积液患者，细胞蜡块联合免疫组化染色诊断有一定的临床应用价值，能够为患者的诊断和癌症分型提供有力的支持，从而可以及时采取有效的方法进行治疗。