淋巴细胞亚群对乳腺癌新辅助化疗疗效的预测价值

钟翠玉，王家维，黄康玲，姚燕丹

乳腺癌是世界范围内的女性最常见的恶性肿瘤之一［1，2］。对于局部晚期乳腺癌患者，新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）可提高保乳手术成功率，有利于患者的进一步治疗［3-6］。一些化疗药物，特别是蒽环类和紫杉类药物，已显示出良好的临床疗效，但是并不是所有患者都对化疗敏感［4，7，8］。因此，预测 NAC 的疗效可以为制定乳腺癌患者的治疗方案提供有价值的信息。近年来，越来越多的因素被提出来用于预测患者NAC 的疗效［9，10］。一些基本的临床特征如肿瘤分级和生物学类型是候选的病理完全缓解（pathological complete response，pCR）预测指标［11］。此外，基因表达分析被认为能够更有效地预测pCR，但由于较高的成本和技术的复杂性，基因检测可能并不适合临床应用［12-14］。因此，探索更多可用于预测NAC 疗效的因素仍是当务之急。

随着近年来人们对肿瘤免疫的研究兴趣高涨，免疫细胞与化疗疗效的关系已被深入研究，其中肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrates lymphocytes，TIL）包括细胞毒T 淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞的水平已被证明是预测化疗敏感性和生存的重要指标［15-17］。一些研究表明，预先存在的免疫反应可能会增强传统化疗药物的疗效［18，19］。然而，大多数研究集中在肿瘤的原位免疫细胞，但乳腺癌是一种全身性疾病，循环免疫细胞与NAC 预后也可能存在潜在的关系。有报道称乳腺癌患者的循环T 淋巴细胞可能比正常人减少［20］。另一方面，NK 细胞在先天免疫介导的肿瘤细胞根除中发挥关键作用，且在适应性免疫中与T 细胞协同发挥作用［21，22］。一些临床研究表明，子宫癌和结直肠癌中循环NK 细胞活性水平降低容易导致转移性播散［23，24］。此外，一些研究人员发现提高外周血NK 细胞水平和维持T 细胞对特定抗原的功能应答可能与乳腺癌患者化疗的良好疗效有关［25］。这些现象提示外周血淋巴细胞的状况也可能与NAC的疗效密切相关。但NAC 前淋巴细胞亚群状态与NAC 疗效之间的确切关系尚不清楚。本研究的目的是评估外周血淋巴细胞亚群在乳腺癌患者新辅助化疗中的潜在预测价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究为回顾性研究，研究对象为2016 年4月至2020 年6 月在中山大学孙逸仙纪念医院治疗的乳腺癌患者，共109 例。纳入标准：①粗针穿刺活检组织学证实为浸润性癌；②诊断为Ⅱ期Ⅲ期；③化疗后手术治疗。排除标准：①第二原发癌或双侧乳腺癌患者；②化疗后未手术患者。所有患者均接受以紫杉醇和/或蒽环类为基础的NAC 方案。大约88%的HER2 阳性乳腺癌患者额外使用了曲妥珠单抗。NAC 后患者接受保乳手术、根治性乳房切除术或改良根治术。所有患者术后均接受化疗、放疗或内分泌治疗。本研究的所有参与者均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会的批准。

1.2 血液样本分析

在NAC 前或术后采集前臂外周静脉血液。血液被用来检测白细胞和淋巴细胞的总数以及淋巴细胞亚群的比例。流式细胞术使用的抗体为BD Multitest 6-color TBNK（Becton-Dickinson，New Jersey，USA）。细胞荧光分析用BD FACS Canto Ⅱ（Becton-Dickinson，New Jersey，USA）按照标准操作进行，数据通过FACS Diva 软件（version 6.1.3；BD Biosciences，New Jersey，USA）分析。 淋巴细胞亚群鉴定如下：CD3+T 细胞，CD3-CD19+B 细胞，CD3-CD16+CD56+NK 细胞，CD3+CD4+T 细胞，CD3+CD8+T 细胞。

1.3 病理

乳腺癌通过粗针穿刺活检诊断，并通过计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、超声成像（US）和骨显像技术进行分期。根据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer）发表的恶性肿瘤TNM 分类对肿瘤进行分期。当核染色阳性的肿瘤细胞≥1%时，认为雌激素受体（ER）或孕激素受体（PR）阳性。免疫组化染色为3+HER2 的肿瘤定义为 HER2 阳性，2+HER2 的肿瘤通过荧光原位杂交进一步分析。Ki67 增值指数也通过免疫组化评估。根据受试者工作特征曲线分析和约登指数，将Ki67 增殖指数的高、低临界值定义为62.5%。在4 μm 的乳腺癌组织切片中通过免疫组化法检测CD3+T 细胞和CD56+NK 细胞。CD3（LN10，NCL-L-CD3-565，QUANHUI IMP& EXP INT’L CO.，LTD，Macau，China）和 CD56（1B6，NCL-L-CD56-1B6，QUANHUI IMP & EXP INT’L CO.，LTD，Macau，China）的免疫组化染色按照说明书的标准程序进行。

用载玻片扫描仪（Mirax Scan；Zeiss，Jena，Germany）对染色载玻片进行全景扫描（放大倍数：200×），从每个染色载玻片中选取五个视野进行评价和评分。CD3+T 细胞或CD56+NK 细胞的密度分为4 类：0，无阳性细胞；1，1%～25%的细胞被染色；2，26%～50%的细胞被染色；3，51%～100%的细胞染色［26］。pCR 是预测 NAC 疗效的有效指标之一。pCR 定义为乳腺癌原发灶和腋窝淋巴结标本中均无浸润性肿瘤细胞残留。

1.4 随访

常规建议患者每3 个月进行一次体检，每6 个月进行一次US 检查，每年进行CT 和放射性核素骨显像检查。通过查询医院病历系统及电话/短信联系对入组患者进行随访，随访时间为从NAC结束起至复发或最后一次随访的日期。随访内容包括生存状态、是否复发、是否转移及具体时间。

1.5 统计学分析

所有的统计分析都使用SPSS 25.0 软件（IBM，Armonk，NY，USA）进行。采用卡方检验分析不同淋巴细胞亚群与pCR 的相关性，以及其它临床病理变量与pCR 之间的相关性。采用二元logistic回归模型对pCR 进行多因素分析。通过Kaplan-Meier 检验分析不同因素与患者无病生存期（DFS）的关系。当P＜0.05 时，认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者的一般资料

共有109 例患者符合标准并纳入研究。纳入患者的基线特征见表1。这些患者的中位年龄为51岁（范围：26～69岁），TNM分期的分布如下：Ⅱ期（N=89），Ⅲ期（N=20）。71.6%的患者发生淋巴结转移。免疫组化结果显示浸润性导管癌占92.7%，小叶癌占3.7%，微乳头状癌占3.7%。在所有病例中，经粗针穿刺活检初步诊断为ER、PR 或HER 阳性的乳腺癌分别占69.7%、56.9%和25.7%。

此外，57 例患者接受紫杉醇+蒽环类为主的化疗方案（52.3%），52 例患者接受（47.7%）紫杉醇/蒽环类为主的化疗方案。19例患者NAC后出现pCR。所有患者化疗后3 周内均行手术治疗，大部分患者接受改良根治术（54.1%）或保乳手术（37.6%）。

表1 109 例乳腺癌患者的基线特征

2.2 NAC 前淋巴细胞亚群与pCR 的关系

根据ROC 曲线及约登指数，确定白细胞计数、淋巴细胞计数和不同淋巴细胞亚群比例的最佳截点。NAC 前淋巴细胞亚群与pCR 的关系见表2。白细胞数、淋巴细胞计数高的患者pCR 率较高，但差异无统计学意义。在不同淋巴细胞亚群中，T细胞比例＞71.9%（P=0.044）和NK 细胞比例＞36.23%（P=0.049）的患者有较高的pCR 率，且差异具有统计学意义。这表明T 细胞和NK 细胞比例可能对NAC 后的pCR 具有预测价值。此外，CD4+T 细胞比例＞37.05%或CD8+T 细胞比例＞23.55%的患者也表现出较好的病理反应，但差异无统计学意义。

一些研究表明，TIL 与多种肿瘤的预后相关，特别是肿瘤浸润T 细胞和NK 细胞较多的患者可能预后较好［27-30］。因此，我们进一步研究外周血中T 细胞或NK 细胞比例较高的患者是否肿瘤部位浸润的T 细胞或NK 细胞也较多。我们在两组患者中分别随机选取了几例患者化疗前和化疗后的肿瘤组织样本，通过免疫组化的方法观察肿瘤部位T 细胞（每组3 例）或NK 细胞（每组2 例）的浸润情况。如图1A 所示，我们发现与T 细胞比例低的患者相比，外周血T 细胞比例高的患者NAC 前肿瘤组织有较多的肿瘤浸润T 细胞。然而，无论外周血中NK 细胞的比例是高是低，NAC 前肿瘤浸润NK 细胞都非常罕见（图1B）。这表明外周血T 细胞的比例可能与化疗前肿瘤部位T 细胞浸润的程度有关。此外，与NK 细胞比例低的患者相比，NK 细胞比例高的患者NAC后肿瘤组织中出现更多的肿瘤浸润性NK 细胞（图1D-F）。

2.3 多因素分析中T 细胞和NK 细胞比例对pCR的预测价值

对 T 细胞比例、NK 细胞比例、Ki67 增殖指数、临床病理参数等变量与NAC 后pCR 的相关性进行单因素分析和多因素分析（表3）。在单因素分析中，T 细胞比例（P=0.044）、NK 细胞比例（P=0.049）和Ki67 增殖指数（P=0.010）与pCR 的相关性具有统计学意义。随后将单因素分析中P＜0.1 的变量纳入多因素分析，包括年龄、Ki67 增殖指数、T 细胞比例、NK 细胞比例。结果证实NK 细胞比例（OR：0.101，95%CI：0.014～0.736，P=0.024）和Ki67增殖指数（OR：0.250，95%CI：0.083～0.752，P=0.014）仍然是pCR 的独立预测因子。

表2 白细胞计数、淋巴细胞计数及不同淋巴细胞亚群与pCR 的相关性

2.4 化疗前后T细胞或NK细胞的变化与pCR的关系

在109 例患者中，83 例患者同时接受了化疗前和化疗后的淋巴细胞亚群检测。因此，我们进一步分析了这83 例患者NAC 前后T 细胞或NK 细胞比例的变化与pCR 的关系。如表4 所示，NAC后76 例患者的T 细胞比例增加，39 例患者的NK细胞比例增加。化疗后NK 细胞比例增加的患者pCR 率较高（P=0.013），差异有统计学意义。大多数患者（91.6%）NAC 后T 细胞比例增加，但T 细胞比例变化与pCR 的关系无统计学意义。

2.5 T 细胞和NK 细胞比例对生存的预测价值

在平均22.37 个月（3.4～50.6 个月）的随访中，13 例患者发生了局部复发或远处转移，8 例患者死亡，4 例患者失访，92 例患者在最后一次随访时未到达随访终点。如图2 所示，T 细胞或NK 细胞比例较高的患者DFS 较长，但差异无统计学意义。此外，NAC 后NK 细胞增多的患者DFS 较长，但仍无统计学意义。

图1 部分患者的肿瘤浸润性T 细胞和NK 细胞 A：CD3 免疫组化染色显示，T 细胞比例低的患者NAC 前肿瘤浸润T 细胞少（评分：a：1，b：2，c：3），T 细胞比例高的患者NAC 前肿瘤浸润T 细胞明显较多（评分：d：3，e：3，f：2）；B：CD56 免疫组化染色显示，无论是 NK细胞比例高还是低的患者，NAC 前肿瘤组织几乎无NK 细胞浸润（评分：0）；C：显示图A 中患者肿瘤部位T 细胞浸润情况的定量比较，两者差异有统计学意义。（P=0.011，t 检验）；D：外周血NK 细胞比例低的患者的肿瘤浸润NK 细胞在NAC 前后无明显差异；E：外周血NK 细胞比例高的患者的肿瘤浸润NK 细胞在NAC 后（评分：1）较NAC 前（评分：0）增多；F：显示图E 中患者肿瘤部位NK 细胞浸润情况的定量比较，外周血NK 细胞比例高的患者在NAC 后肿瘤浸润NK 细胞明显增多

表3 采用单变量和多变量分析方法分析不同因素对pCR 的预测价值

表4 化疗前后T 细胞或NK 细胞变化与pCR 的关系

3 讨 论

淋巴细胞亚群的状况已被报道与某些肿瘤新辅助化疗的预后有关，但其对乳腺癌新辅助化疗的预测价值却很少被提及［20，31］。本研究主要探讨NAC 前不同淋巴细胞亚群比例与NAC 疗效的相关性，发现T 细胞或NK 细胞比例高的患者更容易获得pCR。我们进一步比较了83 例患者在NAC前后的T 细胞和NK 细胞的比例，发现NAC 后NK细胞增加的患者更有可能获得良好的病理应答，这与以往的研究一致［32］。越来越多的证据表明，一些细胞毒性药物可以促进特异性的抗癌免疫反应，这有助于提高化疗的疗效［18，33］。例如，紫杉醇类药物已经被证明可以增强T 细胞和NK 细胞的功能［18，34］。因此，我们推测 NAC 前较高水平的 T细胞和NK 细胞可能有助于化疗过程中诱导抗肿瘤免疫，从而有利于pCR 的诱导。其他几项研究也证实了T 细胞或NK 细胞与乳腺癌NAC 疗效之间的相关性。Muraro 等［32］研究了 78 例乳腺癌患者，证明NAC 期间维持T 细胞对特定抗原的功能应答，提高NK 细胞数量和活性水平可能有助于诱导pCR，特别是对于HER2 阳性乳腺癌患者。另一方面，循环NK 细胞的激活已被证明有助于消除乳腺癌患者的转移性肿瘤［35］。此外，与之前的研究一致，我们的结果表明，高Ki67 增值指数与高pCR率相关，提示 Ki67 也是 NAC 疗效的预测因子［36］。

图2 不同因素的Kaplan-Meier 曲线 T 细胞比例（A）、NK 细胞比例（B）和NAC 前后NK 细胞比例变化（C）与DFS 的关系无统计学意义

最近的研究表明，TIL 在乳腺癌患者NAC 后的 pCR 中起关键作用［17］。Yamaguchi R 等人证明，在高TIL 的病例中，肿瘤浸润T 细胞较多的患者NAC 后更有可能获得pCR［28］。大多数肿瘤只有非常低水平的NK细胞浸润，这与我们的结果是一致的。然而，更多的肿瘤浸润NK 细胞已被证明与一些肿瘤（如结肠和肺）的更好的预后相关［30，37，38］。Kim R 等发现肿瘤浸润NK 细胞的存在可能有利于NAC 诱导的乳腺癌患者抗肿瘤免疫［35］。然而，TIL不能代表全身免疫反应，这限制了其在预测系统治疗效果方面的应用。有趣的是，我们的研究表明，外周血T 细胞比例较高的患者肿瘤部位也有更多的浸润性T 细胞。此外，我们观察到NAC 前外周血NK 细胞比例较高的患者，NAC 后肿瘤部位NK 细胞浸润增多，这也可能与较好的病理应答有关。这些结果提示外周血T 细胞或NK 细胞比例较高的患者，其肿瘤浸润性T 细胞或NK 细胞可能也相应较多。根据这些结果，我们推测系统免疫反应与局部免疫反应密切相关，并与局部免疫反应协同作用发挥抗肿瘤功能，这有待进一步研究。因此，治疗前外周血T 细胞或NK 细胞比例较高，提示机体免疫具有较高的抗癌潜力，这可能预示着较好的NAC 疗效。

此外，我们还分析了外周血T 细胞和NK 细胞对DFS 的预测价值。结果显示，T 细胞和NK 细胞比例较高的患者DFS 较长，但差异无统计学意义。虽然所有结果均无统计学意义，但仍不能认为T 细胞或NK 细胞比例与DFS 没有相关性，因为很多患者随访时间较短，没有达到终点。此外，本研究也有一些其他的局限性。由于本研究为回顾性分析，某些参数的记录不可避免地不完整。因此，我们需要严谨的前瞻性研究来进一步证实和扩展我们的发现。

本研究提示NAC 前T 细胞和NK 细胞的高比例是pCR 的重要预测因子，这可能与化疗诱导的抗肿瘤免疫有关。另外，化疗后NK 细胞比例的增加也表明更有机会获得pCR。该指标可以从血液中获得，不需要任何特殊设备或侵入性程序，比现有的一些指标更容易检测。本研究结果可能为癌症治疗提供新的思路，但需要进一步的前瞻性研究来证实这一点。