骨骼肌线粒体与脂滴动态变化及相互联系研究进展

郑 义，徐晓阳，薄 海，张 勇

骨骼肌是人体最大的运动器官，其重量约占总体重的40%。线粒体是骨骼肌纤维的主要能源工厂，主要通过TCA循环及β氧化分解糖类与脂类产生能量。脂滴是中性脂质（主要为甘油三酯）、磷脂及胆固醇的主要贮存细胞器，广泛分布于真核细胞中。骨骼肌纤维的脂滴直径在0.04～100μm左右[1]，由磷脂单分子层包裹。线粒体与脂滴由于其生物学特性都存在十分活跃的动态变化，多项研究均表明线粒体与脂滴可以通过融合分裂的动态变化进行相互接触，且两细胞器之间的动态接触可以随外界环境及干预方式的改变发生相应的变化。线粒体与脂滴的相互接触联系在脂质代谢与能量底物转换方面起着十分重要的作用，因此揭示骨骼肌线粒体与脂滴之间的相互联系有助于人们更深层次的发现与了解两细胞器间相互作用的生理与生化意义。本综述尝试从线粒体融合分裂与脂滴相关研究中总结出两细胞器的动态变化及相互联系，为更好的理解骨骼肌线粒体与脂滴之间的相互联系及变化提供实验与理论依据。

1 线粒体概述

线粒体是真核细胞中制造生命所必需能量的重要细胞器。目前认为，线粒体来源于其他细胞生物，且线粒体是除细胞核以外唯一具有DNA的细胞器，即“线粒体伴随内共生进化”理论。线粒体由线粒体外膜（OMM）、膜间隙（IMS）、线粒体内膜（IMM）和可溶性基质（Matrix）组成。线粒体外膜参与线粒体与胞质之间进行的代谢交换，并与其他细胞器产生物理接触，稳定线粒体形态；线粒体内膜由边界膜（Boundary）和嵴（Cristae）构成，边界膜平行于线粒体外膜并允许蛋白在线粒体内膜和基质之间进行交换；线粒体嵴是线粒体内膜进入基质的突起，扩大了线粒体内膜的表面积，同时也是发生氧化磷酸化（OXPHOS）的电子传递链复合体的关键位置。线粒体是一种高度动态变化的细胞器，线粒体持续不断地发生融合与分裂的动力学变化对于线粒体生物合成、自噬、凋亡乃至细胞生物遗传与功能维持都至关重要。

1.1 骨骼肌线粒体融合机制

骨骼肌纤维中线粒体的形态与结构是不断变化的，线粒体需要不断的通过融合与分裂以来保持其形态与功能的完整性[2]。当骨骼肌纤维线粒体的融合程度大于分裂时，线粒体则多呈现“管状”（tubular）结构；而当分裂大于融合时，线粒体则呈现“碎片化”（fragment）颗粒结构[3]。由于线粒体的双层膜结构，线粒体的融合与分裂则需要完成线粒体外膜与内膜的融合与分裂。一般认为线粒体融合需要线粒体外膜的融合与内膜的融合，两者调控机制略有不同。线粒体外膜融合在线粒体融合蛋白1（MFN1）及融合蛋白2（MFN2）的调控下进行，虽然有研究[4]表明，MFN1在线粒体融合功能方面更加专一且似乎更强于MFN2，但MFN1与MFN2两者作用具有一定的互补性。MFN1和MFN2经由高度相似的卷曲螺旋结构域（HR2结构域）相互作用形成同源（即MFN1-MFN1或MFN2-MFN2）或异源（MFN1-MFN2）二聚体，并依赖于GTPase水解从而介导线粒体外膜的融合[5]。线粒体内膜融合在视神经萎缩蛋白1（OPA1）的介导下进行。人类OPA1的mRNA有8种构型，由于来自外显子4、4b与5b的选择性剪切，mRNA可以编码924到1 014种氨基酸的8种OPA1蛋白。OPA1蛋白N端均包括一个线粒体靶向序列，后接一个跨膜结构域（TM），此结构域嵌入IMM及一个螺旋结构域中[6]。通过OMM和IMM转位酶导入OPA1前体蛋白后，线粒体靶向裂解产生内膜锚定的OPA1长型（L型），L-OPA1可在N端进一步蛋白水解处理，产生可溶于线粒体膜间隙的OPA1短型（S型）[7]。迄今发现2种IMM肽酶参与了OPA1的剪切：OMA1与YME1L。正常通常情况下，YME1L保持激活状态；但在压力、线粒体功能障碍（ATP合成下降、膜电位下降等）及凋亡等情况下，OMA1持续激活并与YME1L产生拮抗作用，使YME1L失活[8]。通常认为细胞可通过L-OPA1与SOPA1的比例调控线粒体融合及线粒体嵴结构等功能。线粒体融合对于线粒体动态稳定性具有十分重要的意义，MFN2缺陷成纤维细胞虽然内源耦合呼吸未发生变化，但表现为线粒体膜电位的显著下降。线粒体膜融合使不同的线粒体膜与线粒体基质进行物质交换，减少mt DNA的突变，促进线粒体间的相互协同与网状结构的形成，从而有助于恢复因应激导致的局部线粒体缺失、减少脂溶性代谢物与氧扩散时间，进而维持线粒体的基本功能[9]。

1.2 骨骼肌线粒体分裂机制

调控骨骼肌线粒体分裂的蛋白有DRP1（又被称为DNM1L）、FIS1、MFF等，其中DRP1是真核生物参与线粒体分裂的最主要蛋白。DRP1介导线粒体分裂的过程如下：分裂开始时，线粒体外膜的DRP1受体（MFF、FIS1以及MID49/51等）将DRP1募集于于线粒体周围，DRP1可形成多聚体并形成环状螺旋，成环而绕在线粒体表面，其进而通过水解GTP为分子构象改变提供能量，DRP1环收缩从而使线粒体分裂成两个子线粒体[10]。分裂完成后，蛋白激酶A（PKA）通过磷酸化DRP1 656位丝氨酸残基介导了DRP1磷酸化，将P-DRP1后从OMM转位至胞质中，随后降解失活[11-12]（见图1）。有研究[13]表明，在使用mdivi-1（DRP1抑制剂）干预C2C12细胞后，线粒体趋于融合态且氧化能力有所增加。也有文献[14]表明，S-OPA1参与了线粒体分裂。线粒体分裂可以通过分裂功能失调的部分线粒体从而减轻线粒体损伤，减轻线粒体损伤所带来的负面效果。

图1 线粒体融合与分裂调控模式图[12]Figure1 Regulation of MitochondrialFusion and Fission[12]

1.3 运动与营养对线粒体融合与分裂的影响

正常情况下，骨骼肌线粒体处于高度动态平衡中。但是在高脂、高糖营养状况下，胰岛素抵抗（IR）、二型糖尿病（T2DM）情况下，骨骼肌线粒体融合分裂平衡则有可能会被打破。不同形式的运动对骨骼肌线粒体融合与分裂的作用也不尽相同。早期的研究[15]表明，随着有氧运动时间的增加线粒体数量明显增加，体积变大，线粒体嵴成管状；但力竭运动后线粒体膜与线粒体嵴均出现了不同程度的溶解。H.DING等[16]报道随着一次大强度急性运动时间的增加，骨骼肌mfn1/mfn2 mRNA的表达逐渐下降，同时骨骼肌MFN1蛋白水平下降，而骨骼肌fis1 mRNA表达和FIS1蛋白含量显著升高，上述结果提示一过性大强度运动后骨骼肌线粒体趋向于分裂。研究表明一次大负荷离心运动后骨骼肌线粒体分裂蛋白表达也显著增加。此外有研究[17]表明离心运动后即刻针刺可以显著降低线粒体Cyt-C浓度并提高线粒体膜电位水平，通过抑制线粒体自噬蛋白FNDC1的表达抑制线粒体分裂。钱帅伟等[18]报道急性跑台运动后骨骼肌MDA含量显著上升，SOD活性下降，自由基（reactive oxygen species，ROS）水平显著升高，提示急性运动后ROS大量增加可能是线粒体分裂的诱导因素之一。N.P.GREENE等人[19]研究发现高脂饮食降低了骨骼肌MFN2、OPA1的蛋白表达量，但对DRP1的表达并未产生显著影响，而随后4周中等强度耐力运动干预则显著提高了骨骼肌OPA1的表达。上述几项研究的实验对象均为成年个体，而L.GAUDET等人[20]的研究表明表面年轻个体短时间内高脂饮食干预并未损伤趾长伸肌（EDL）的线粒体融合分裂蛋白表达，但比目鱼肌（SOL）DRP1的表达量则显著增加了4倍，提示线粒体融合分裂能力与个体年龄、暴露时间及肌肉类型分型均存在一定关系。而最新的一项研究中，S.PATTANAKUHAR等人[21]发现运动与热量限制节食（Caloric Restriction，CR）均可在一定程度上减轻高脂干预对骨骼肌线粒体造成的损伤，即增加骨骼肌MFN2表达并降低DRP1的表达。

2 脂滴及脂滴动力学

早期的研究认为，脂滴仅仅是储存脂质的细胞器。在营养过剩的情况下，底物以脂质特别是甘油三酯的形式被储存在脂滴中；当机体处于饥饿或运动等应激状态下，细胞便可通过β氧化释放游离脂肪酸满足机体的能量需求。然而直到最近几十年脂滴关于代谢、调节等的重要作用才被重新认知。脂滴的形成机制迄今为止尚无明确的定论，经典的“出芽”（Budding Off）模型指出内质网内的球形结构脂醇通过“出芽”方式形成了脂滴[22]，这一模型也解释了围脂滴蛋白与载脂蛋白同源性的原因。近年来另一种脂滴生成模型也有所发展，即脂质积累于在内质网小囊泡膜一侧，最终压迫形成脂滴并释放至胞质[23]。上述两种模型虽然不相互排斥，但这两种假说者均缺乏足够的实验证据。

由于脂滴和线粒体都是高度动态的细胞器，近些年的研究中已有人比照线粒体动力学提出了脂滴动力学的概念。由于脂滴主要储存中性脂质即甘油三酯（Triglyceride，TAG），故脂滴的合成与增长则与细胞内TAG的转运与合成密不可分。外源性TAG无法直接进入骨骼肌，在被分解为游离脂肪酸（FFA）后通过细胞膜上CD36、FADP及FATP等转运蛋白进入胞质[24]，并在胞质中以磷酸甘油酯（glycerolphosphate）为底物合成TAG。二酯酰甘油酰基转移酶（DGAT）与脂质蛋白1（Lipin1）等是TAG合成的关键酶并定位于脂滴上[25]，故脂滴在一定程度上参与并加速了胞内TAG的合成。TAG被分解为FFA参与β氧化，但过多的FFA则会破坏细胞膜的完整性，进而导致线粒体功能失调，使线粒体产生并积累过多的ROS与有毒脂类（如丙二醛Malondialdehyde，MDA），进而引发炎症反应乃至凋亡，即脂毒性。

2.1 围脂滴蛋白（PLIN）简介

围脂滴蛋白（PLIN）是与脂滴相关的蛋白，最初由Greenburg从脂肪细胞中分离并发现。2002年Miura按照围脂滴蛋白被发现的先后顺序将其命名为PLIN1（perilipin）、PLIN2（ADRP、ADFP）、PLIN3（Tip47）、PLIN4（S3-12）与PLIN5（OXPAT、LSDP5）[26-27]。其中PLIN1仅在脂肪组织中表达，PLIN5在氧化型组织（心脏、骨骼肌、肝脏等）中广泛表达，其它3种PLIN蛋白均在组织中广泛表达。研究表明骨骼肌PLIN蛋白中PLIN2仅定位于脂滴上[28]，PLIN4虽然表达量较高但仅定位于胞质中，而PLIN3与PLIN5可定位于脂滴、胞质与线粒体中。细胞中特异敲除PLIN2后PLIN3替代了PLIN2的部分功能[29]，所以推测PlIN家族蛋白在某种程度上有可能存在功能的互补。

2.2 脂滴融合机制

脂滴是高度动态的细胞器，其融合与分裂机制在很长一段时间内不为人知。脂滴融合机制又可分为两种：CIDE蛋白介导的脂滴融合与快速脂滴融合（Lipid droplet coalescence，LDC）[30]。快速脂滴融合目前研究较少，本文仅讨论CIDE蛋白介导的脂滴融合。CIDE蛋白介导的脂滴融合由J.YU等近年来所发现，是一种非典型（atypical）融合[31]，其具体步骤可被概括为：（1）不同脂滴在胞质中通过微管快速移动至相同位置；（2）脂肪特异蛋白27（Fsp27，别名CIDEc）和细胞死亡诱导DNA片段化因子α样效应子a（CIDEa）在脂滴间的接触位点处高度富集[32-33]，上述过程受到CIDE蛋白家族及Rab8a[34]的调控；（3）融合孔洞形成并在PLIN1的帮助下稳定化[35]，脂质交换同时脂质从小脂滴向大脂滴定向移动，脂滴实现了融合与生长；（4）融合结束后，参与上述过程的融合蛋白复合体被拆散，CIDE蛋白等在脂滴表面进行重新分配（见图2）。脂滴融合可在不同组织脂质储存的不同生理条件与阶段发生，但其主要目的是促进直至积累与能量物质的有效储存，并降低因脂质积累所造成的脂肪变性与脂毒性。由于PLIN1仅表达于脂肪组织且在骨骼肌中不表达，所以骨骼肌中上述脂滴融合过程是否由其他PLIN蛋白进行调控尚需进一步研究。

2.3 脂滴分解（lipolysis）与脂噬（lipophagy）机制

脂滴可通过脂解（lipolysis）作用释放FFA进入胞质，在肉毒碱（Carnitine）帮助下通过肉碱棕榈酰转移酶1b（Carnitine Palmitoyltransferase 1 beta，CPT1b）[36]穿越骨骼肌线粒体外膜进行β-氧化。其具体机制为：TAG在脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）作用下分解为二酰基甘油酯（Diacyl glycerol，DAG）及一分子游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）。ATGL的活性受到a/β水解酶结构域蛋白（Comparative Gene Identification-58，CGI58；，别名Abhydrolase domain containing 5，ABHD5）与G0/G1开关基因2（G0/G1 switch protein 2，G0S2）的正向与负向调控[37]。骨骼肌脂滴表面Plin5与CGI58相结合，当PLIN5磷酸化后，CGI58与PLIN5分离并与ATGL结合，使其活性提高数十倍并锚定ATGL于脂滴表面进行脂解[38]。G0S2则可通过抑制ATGL活性抑制脂解[39]。激素敏感性脂肪酶（Hormone-sensitive Lipase，HSL）参与后续的脂解过程。HSL有6个磷酸化位点，可被AMPK与PKA磷酸化。P-HSL具有生物活性，可将DAG水解为单酰基甘油酯（Monoglyceride，MAG），释放1分子FFA[40]。通常认为可分解MAG的单酰甘油酯酶（Monoacylglycerol lipase，MAGL）在脑、白色脂肪组织与肝脏中高表达，在骨骼肌中不表达或表达量过低。但S.K.JIANG等[41]研究表明MAGL在骨骼肌受伤愈合过程中表达增加，提示其参与了炎症反应。

2009年R.SINGH等人[42]发现长时间禁食状态下，脂肪细胞中的脂滴可以和自噬小体结合并被转运至溶酶体分解，释放游离脂肪酸FFA进行后续的β氧化，上述异于脂解释放FFA的过程被定义为称为脂噬（lipophagy）。T.LAM等人[43]报道在慢性脂质积累情况下，脂噬通过P62介导的非溶酶体途径促进L6细胞脂质分解，但具体机制尚不清楚。已有大量的研究表明，运动可以提高骨骼肌脂质分解能力。杨毅[44]报道抗阻运动、耐力运动及混合运动均可提高ATGL与HSL的mRNA表达水平。特异性敲除ATGL基因后，大鼠骨骼肌糖摄入增多但未影响胰岛素敏感性[45]，提示脂质分解过程中不同脂肪分解酶存在协同与互补作用。

3 骨骼肌线粒体与脂滴相互联系

骨骼肌线粒体与脂滴都是高度高动态的细胞器，两者在数目、形态上维持着微妙的平衡，而这种平衡会随着一方或双方的急剧变化受到可逆或不可逆的破坏。T2DM个体中，当脂肪摄入增加而能耗不变时，骨骼肌肌内脂质（Intramyocelluar lipid，IMCL）增加，脂滴趋向于融合巨大化，线粒体趋向于分裂碎片化，骨骼肌出现脂肪的异常积累（异位脂肪积累）或脂肪变性，且骨骼肌异位脂肪积累或脂肪变性与机体IR程度呈正相关，IR患者骨骼肌Ⅱ型肌纤维肌膜下区域脂滴出现大量积累；Y.TACHI等人[46]的研究表明在慢性肝病患者中骨骼肌脂肪变性患者占总调查人数的82%，93%的具有骨骼肌减少症状的患者同时存在骨骼肌脂肪变性，赵斐[47]的电镜实验结果显示，高脂喂养组大鼠腓肠肌中呈现数目较多且形态较大的脂滴，线粒体体积小且数量稀少；而高脂喂养+运动组大鼠腓肠肌脂滴较少且形态较小，线粒体体积变大，数量增多。上述形态学结果提示运动可以在一定程度上抑制因脂肪过多摄入而导致的骨骼肌脂肪变性；而在运动员特别是耐力运动员个体中，骨骼肌IMCL增加的同时骨骼肌线粒体数量也同时增加，且运动员骨骼肌IMCL与IR的发生不相关，这种与T2DM病人所不同的现象被称为“运动员悖论”（Athlete Paradox）[48-49]。虽然运动员悖论现今尚无可以全面解释的学说出现，但这种现象提示与线粒体及与脂滴动力学间的相互作用可能有着十分重要的关联。

运动应激状态下骨骼肌线粒体融合与分裂状态都较为活跃，此种活跃的状态可能允许骨骼肌纤维容纳更多较为“活跃”的脂滴。M.ROGNE等人[50]在其2011年的研究基础上利用邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）证明了在白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）中S-OPA1作为激酶锚定蛋白（A-kinase-anchoring protein，AKAP）引导PKA磷酸化PLIN1的S497与S522位点，P-PLIN1从脂滴转位到胞质从而促进脂滴分解的过程，而当人为的干扰OMA1后，LOPA1则不能作为AKAP介导PKA磷酸化PLIN1，提示由OMA1切割L-OPA1形成的S-OPA1参与了WAT脂滴的脂解过程。此外同时间M.BOUTANT等人[51]的研究发现BAT中线粒体MFN2蛋白可以与脂滴PLIN1蛋白产生免疫沉淀。当特异性敲除BAT的MFN2蛋白后可以观察到BAT线粒体与脂滴之间相互接触变少且两者相互分离，脂滴变大增多而线粒体趋向于分裂。但有意思的是，将BAT特异性敲除MFN2的大鼠却可以在一定程度上保护机体抵抗由HFD引起的IR，而这种保护作用却正是以牺牲细胞脂肪酸氧化能并增加无氧氧化为代价，提示线粒体与脂滴间的相互联系作用有助于脂肪酸的氧化代谢。上述研究表明，线粒体融合与分裂很可能与脂滴具有直接相互联系作用。

早期研究已观察到线粒体与脂滴间存在紧密抑或短暂的相互作用，而这种相互作用会在机体饥饿的条件下增加，也从另一方面说明线粒体与脂滴的相互作用是一种脂滴配合线粒体增加脂肪酸氧化的机制。但I.Y.BENADOR等人[52]在最近的研究中发现通过物理方法从BAT中分离的部分线粒体与脂滴上存在线粒体且两者连接紧密，为区别存在于胞质线粒体（Cytoplasmic mitochondria，CM）他们将其命名为围脂滴线粒体（Peridroplet mitochondria，PDM）。PDM对于丙酮酸和苹果酸的氧化能力高于CM，但对脂肪的氧化能力较低。同时PDM被证明具有更高的ATP合成能力及更高的ATP合酶表达水平。PDM中ATP的合成增加使脂滴中脂质酯化并增加脂滴的体积。L.CUI等人[53]更进一步证明此种连接并非物理连接且十分紧密（无法用物理离心方法分开），同时证明了这种线粒体与脂滴的紧密接触并非依赖于围脂滴蛋白PLIN2与PLIN5，并延伸出脂滴锚定化线粒体（LD-anchored mitochondria，LDM）的概念。PDM或LDM相较于CM似乎并非专门进行脂肪酸氧化，其作用可能为专门帮助BAT脂滴的脂质储存；虽然PDM中MFN2表达量较高，与CM相比PDM似乎十分“惰性”，PDM与CM不相互融合且不共享线粒体内容物。尽管PDM附着于脂滴上，PDM的运动能力明显降低。这种新发现使线粒体的传统功能即能量代谢开始受到一定程度的质疑。从上述几项研究可推测线粒体与脂滴间的联系作用可能存在两种形式，即永久接触联系及动态接触联系，其中只有动态接触联系似乎可由线粒体与脂滴动力学解释，而永久接触联系尚未具有可靠的理论支撑。L.CUI等人[53]也证实这种永久接触联系是在BAT分化末期才形成的，BAT未分化前尚不存在线粒体与脂滴的永久接触联系，提示PDM与LDM与CM具有同源性，但其分化机制未知。值得注意的是，受过运动训练的个体骨骼肌具有较高的PLIN5水平，且有更多的PLIN5包覆的脂滴[54]。尽管上述几项研究的立足点与出发点不尽相同（线粒体-脂滴或脂滴-线粒体），且均聚焦于脂滴丰富的脂肪组织中，而且并未详细讨论运动或疾病模型对于线粒体与脂滴动力学互作程度的干预作用。虽然有形态学证据证明PLIN5与线粒体标志蛋白TOM20共定位于线粒体外膜[55]，但是骨骼肌中线粒体与脂滴的直接作用或骨骼肌线粒体是否也存在PDM或LDM尚未见诸报道。

4 结论与展望

骨骼肌线粒体与脂滴都是高度动态化的细胞器，其动态膜结构是两细胞器相互联系的结构基础。现有的研究结果提示骨骼肌线粒体与脂滴动态变化间很可能存在着重要的相互联系，并在骨骼肌的物质转运和脂质代谢方面发挥着不可忽视的作用；运动可能会通过改变线粒体融合与分裂能力进而影响脂滴改变能量代谢，从而在一定程度上改善因高脂饮食及T2DM引起的骨骼肌线粒体与脂滴功能紊乱。但骨骼肌线粒体融合分裂与脂滴之间如何间接或直接相互联系？此种联系是动态接触联系还是永久接触联系？上述问题还有待进一步研究探索与解决。