锚蛋白重复结构域1的研究进展

黄川明 陈日玲

【摘要】 锚蛋白重复结构域1（ANKRD1）也被称为心肌锚定重复序列蛋白（CARP），由ANKRD1编码，是一种应激反应蛋白，为细胞质中的重要组成部分，而且是细胞核转录的重要辅助因子。其在细胞的表达水平，定位甚至病理应激类型不同，可发挥不同的功能。CARP作为肌肉锚蛋白重复蛋白家族的一员，在各种心脏疾病中高表达，但其发挥作用的机制及对相关病理生理学仍不清楚。本文从ANKRD1的结构及其在心脏疾病中的作用进行阐述。

【关键词】 锚蛋白重复结构域1 心肌锚定重复序列蛋白 心脏疾病

Research Progress of ANKRD1/HUANG Chuanming， CHEN Riling. //Medical Innovation of China， 2021， 18（20）： -188

[Abstract] ANKRD1 also known as cardiac anchored repeat protein （CARP）， is a stress response protein encoded by ANKRD1， ANKRD1 is an important component of cytoplasm and an important cofactor of nuclear transcription. The expression level， location and even pathological stress type of cells are different， which can play different functions. As a member of ankyrin repeat protein family， CARP is highly expressed in various heart diseases， but its mechanism and pathophysiology are still unclear. Here we describe the structure of ANKRD1 and its role in heart disease.

[Key words] ANKRD1 CARP Heart disease

First-author’s address： Guangdong Medical University， Zhanjiang 524003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.20.045

1995年，Chu等[1]首次在白介素（IL）-1A和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人血管内皮细胞中发现心肌锚蛋白重复蛋白（cardiac anchinin repeat protein，CARP）为细胞因子诱导因子（C-193）。随后，它也被发现分布于肌节I带中，与肌联蛋白相互作用[2]。CARP在细胞中不同定位有不同作用，在骨骼肌及心肌细胞中，主要分布在细胞核之间，它与YB-1等转录因子相互作用，扮演转录共调节蛋白的角色，在细胞质中，它与其他肌浆蛋白结合，成为结构或信号传导成分[3-6]。CARP的基因被鉴定为一个胎儿基因，CARP在胚胎和胎儿心脏发育阶段检测到高水平表达，随着年龄增长，特别是在成年人中，其表达水平明显降低，越来越多的证据表明，CARP突变可导致各种心血管疾病，包括肥厚型心肌病、扩张型心肌病和心力衰竭等[7-9]，但其具体机制仍不清楚。细胞凋亡在心衰的发展过程中起着至关重要作用[10]，人们认为肿瘤抑制基因p53和Bax促进心肌细胞凋亡，有趣的是，最近有证据表明CARP充当p53的共激活因子，并调节其转录活性，这些发现提示CARP可能通过促进心肌细胞凋亡而加速心肌疾病的进展[11]。目前，关于锚蛋白重复结构域1（ANKRD1）影响其他细胞凋亡的研究较少，来自韩国实验室的三份报告表明，ANKRD1的异位表达可促进肝癌细胞凋亡[12]。这使得CARP的高水平表达是有利还是有害仍没有共识。这些发现表明CARP对细胞凋亡的影响可能与环境及不同类型的细胞相关。

1 结构

CARP位于人类10q23.31号染色体上，其cDNA全长约1 900个碱基对，由ANKRD1基因编码，共编码319个氨基酸的蛋白产物，分子量约37 kDa，其序列在哺乳动物中高度保守[13]。CARP蛋白由以下几个特点，（1）卷曲螺旋域：由2～5个α螺旋组成的超螺旋相互缠绕形成，在结构上可以介导蛋白质的齐聚;（2）串联锚蛋白重复序列：CARP在蛋白C端有数个重复序列，存在着反α螺旋和右手螺线管型结构，介导蛋白与蛋白之间的作用，具有多种功能，包括转录调控、细胞周期调控、离子运输、细胞骨架完整性、内吞作用和信号转导等;（3）核定位信号;（4）PEST样区域：该区域富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸，参与蛋白质的快速降解，因此，许多短寿命蛋白中均有表达，如G1细胞周期蛋白和p53等;（5）多个蛋白磷酸化位点：这些位点可被蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ等酶磷酸化，如蛋白激酶C能在Thr11、Ser305位点被磷酸化;此外，在5’-非翻譯区，CARP含有9个外显子和几个典型的元件，包括GATA-box、AT-rich、E-box和TATA-box[14-15]。对于不同的物理、化学刺激和在特定的环境下，CARP也呈现出不同表达水平。例如，在抗肿瘤药物阿霉素的环境下，CARP表达受到明显抑制，缺氧和热应激则会轻度降低CARP表达;相反，在IL-1α和TNF-α刺激下，人血管内皮细胞中CARP的mRNA显著增加，在小鼠的心肌细胞中也可得到相同的结果。另外，在疲劳运动、伤口愈合和血管生成的过程中，其在骨骼肌中的表达也会明显增加。到目前为止，已经发现了几个与CARP相关的具有多种功能的物理伴侣，表明其具有多种功能，如与参与生物力学应力传感的肌蛋白相互作用，并与肌体完整性相关的肌蛋白密切联系。它还与Y-box转录因子1及连接酶MuRF1一起调控蛋白质的精确翻译，也有证据表明，CARP能预防过早细胞衰老的细胞凋亡[16-17]。

2 CARP/ANKRD1与心脏疾病的关系

心肌肥厚是心脏后负荷增加的适应性反应，其特征是心室肥厚和舒张功能障碍，并伴有心肌细胞的增大和心肌成纤维细胞合成增强[18]。心脏CARP的表達在各种肥厚性刺激（包括压力超载和机械应激）反应中显著增加，有大量研究证实了这一现象[1，4]。Song等[19]培养了CARP过表达的转基因小鼠，通过与野生型小鼠相比，发现它们在对压力超载的反应中，心肌肥厚明显减少，他们认为CARP可以通过抑制心肌细胞介导的ERK1/2和TGF-β通路，减少心肌细胞纤维化，从而减轻心肌细胞肥大;通过增加TGF-β可以逆转CARP对异丙肾上腺素引起的心肌细胞肥厚反应的抑制作用，从而证实CARP的表达是对各种应激的适应性和保护性反应。相反，Bang等[20]对敲除CARP等基因的4个月龄小鼠和野生型小鼠进行了动脉收缩（TAC），采用超声心动图评价TAC术前和14 d的心功能，发现两组压力梯度相似，心室壁厚度和体积增加程度均相当，表明CARP对心脏的正常发育和功能以及对机械压力过载的反应不是必需的。文献[21]通过分析384例心肌肥厚患者，在试验组和对照组均发现了内含子变异、非同义替换和同义变异，但在心肌肥厚组检测到了3个错义突变，Pro52Ala、Thr123Met、Ile280Val。他们认为CARP突变影响了其与肌动蛋白的作用及在细胞中的定位，从而影响了其基因调控功能。这提示了CARP在维持肌节或肌蛋白功能完整性上有着重要作用[4]。因此，CARP目前在肥厚细胞中的作用仍有较多争议，其在心肌肥厚的具体机制及调控仍有待进一步研究。

扩张性心肌病（DCM）是指在没有异常负荷条件（高血压、瓣膜病）或足以引起整体收缩功能损害的冠状动脉疾病的情况下，存在左心室扩张和收缩功能不全。Duboscq-Bidot等[22]对231例DCM患者的ANKRD1编码区进行了测序，发现2例家族突变（p.Thr116Met和p.Ala276Val）和3例散发病例（p.Glu57Gln、P.Arg66Gln和p.Leu199Arg突变），并在遗传和功能分析的基础上验证了这一突变。他们认为这些突变影响了高度保守的氨基酸残基，同时也抑制了MLC2v启动子和影响肌蛋白功能，从而影响了信号传导和蛋白功能，导致疾病发生。Moulik等[23]在4例DCM患者中，发现了3种错义突变（P105S、V107L和M184L）。M184L突变导致CARP与Talin1和FHL2的结合缺失，P105S突变导致Talin1结合缺失，这些突变影响了心肌细胞正常的信号传导以及肌节和细胞骨架结构成分。另外，P105S突变可导致p53下调，这意味着CARP与心肌细胞的生长周期和凋亡相关[24]。因此。CARP可能在扩张性心肌病发挥着积极作用，但这需要进一步去验证，其具体机制也不清楚。

心力衰竭主要是由潜在的心肌疾病引起的，然而，心脏瓣膜疾病、心内膜或心律失常也可能导致心脏功能障碍。在心力衰竭患者中，发现心肌CARP水平显著增高，提示CARP的表达在心衰的过程中发挥着重要的作用。Kempton等[25]早期研究表明了细胞骨架蛋白βⅡ参与蛋白翻译以及在心力衰竭患者表达显著增加，后来又证实βⅡ蛋白调控着CARP表达，他们的研究表明CARP是一种动态分子，随后负荷与压力改变而变化，并且认为其有潜力作为一种生物标志物来评估心室辅助治疗的预后指标。Herrer等[26]通过对29例心脏病患者进行RNA测序分析，发现细胞骨架在心力衰竭患者中出现改变，他们鉴定出包括CARP在内的60个细胞骨架相关基因，进一步研究得出CARP可影响细胞骨架变化，导致心肌细胞结构破坏，影响了心肌细胞的收缩能力。

阿霉素（Dox）是一种蒽环类抗肿瘤药物，它可以破坏心脏特异的基因表达程序，引起肌节紊乱和肌丝丢失为特征的依赖性心脏毒性，这极大地影响其在临床中的应用。Jeyaseelan等[27]发现一种在心肌细胞中表达明显增加的核蛋白，其mRNA水平对Dox非常敏感，因此他们将其命名为心脏阿霉素反应蛋白（CARP）。而该研究证实了CARP可以抑制阿霉素对细胞引起的氧化应激作用，其中丝氨酸/苏氨酸激酶通路起着关键作用。Chen等[28]在共转染实验中发现，GATA4通过激活CARP近端启动子而作用与CARP上游，用腺病毒过表达GATA4维持其在心肌细胞中的水平，可稍微提高CARP的表达，并减少Dox引起的肌节紊乱，该研究表明，阿霉素同时消耗心肌细胞中的GATA4和CARP，在一定程度上参与了肌纤维紊乱和蒽环类心肌病的病理生理过程[16]。

细胞凋亡的特征是细胞聚集（固缩），细胞体积减少，染色质凝结和核碎裂，而细胞膜保持完整性。外部和内部刺激可以触发死亡受体介导（外部）或线粒体介导（内部）的凋亡。死亡配体如TNF-α和Fas配体与各自的膜受体结合，激活死亡受体通路。而CARP正是在TNF-α刺激下，诱导血管内皮细胞表达水平增加的，说明了CARP也参与细胞凋亡的作用。线粒体的损伤导致不规则的氧化磷酸化、活性氧（ROS）增加引起的氧化应激以及线粒体外膜通透性的改变。Bax/Bak是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，受Bcl-2及其相关抗死亡的蛋白负调控。大鼠心脏缺血缺氧再灌注损伤，可诱导凋亡相关基因GADD153过表达，导致CARP下调，表明CARP具有抗凋亡作用。Zhang等[16]的研究表明，在体外缺氧/复氧和体内缺血/再灌注实验模型，CARP作为转录因子GATA-4的辅助因子，可诱导抗凋亡基因Bcl-2的表达，进一步支持CARP作为抗凋亡因子的作用。相反，Shen等[11]研究表明，CARP高水平表达可通过p53蛋白影响线粒体功能而促进心肌细胞凋亡。另外，也有证据表明CARP与人类肝癌细胞凋亡增加相关。Caspase是一类内源性蛋白酶，在程序性细胞死亡和炎症中发挥重要作用。在哺乳动物中，caspase 3可以激活caspase级联信号，负责执行凋亡。研究表明，CARP在靠近其N端残基区域被caspase 3剪切，说明CARP参与了细胞凋亡作用，然而，随后的一项研究表明，采用caspase 3抑制剂并不能影响大鼠心室细胞CARP的降解[17]。因此，CARP似乎能在不同条件下增强或抑制细胞凋亡，这些发现表明CARP对细胞凋亡的影响可能与环境及不同类型的细胞相关。

目前對于CARP的调控机制尚不清楚。CARP启动子活性的调控转录增强因子-1（TEF-1）作为CARP启动子基础活性的必需结合因子，结合在M-CAT元件上，可能在蛋白激酶通路下游中调控CARP的表达。作为Nkx2.5的下游靶点，Nkx2.5直接控制CARP的启动子活性来激活转录，另外有证明表明GATA-4也参与其中。此外，肿瘤抑制因子p53可上调骨骼肌细胞中CARP启动子的活性;GADD153在缺氧诱导的凋亡过程中，可降低CARP的表达。文献[17]认为，泛素-蛋白酶体酵解途径是调节蛋白质的主要机制，其提供了一种蛋白质质量的控制形式，对维持心脏功能至关重要，CARP和骨骼肌细胞特异的RING（really interesting new gene）和MuRF2相互作用，这两种蛋白是与肌节相关的E3泛素连接酶，催化泛素向蛋白质底物转移，并向蛋白酶体降解发出信号。此外，caspase 3作为细胞凋亡的执行蛋白，也有研究证实其在CARP编码区域有相应的剪切位点[17]。因此，对于CARP的表达是多种因素控制的，并且因不同的病理刺激和细胞类型，其结果可能不同。

3 小结

CARP是一种多功能蛋白，如在胎儿心脏基因表达的负转录调控、肌纤维组装、心肌细胞的重塑、细胞骨架蛋白和对机械刺激的信息传递。它在体内高水平表达是心脏的致病因素，还是对心脏损伤的适应性反应，这仍不清楚。作者认为，根据现有的数据，对于CARP在心脏中表达增加，更是一种对心脏的积极保护作用，但是如果不给予控制，可能会适得其反，反而加重心脏疾病的病理生理过程。

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（收稿日期：2021-05-10） （本文編辑：张爽）