丙泊酚麻醉对老龄大鼠认知功能和海马神经元γ-氨基丁酸A受体表达的影响

邱 洁,孙 虎,谢 爽,张彩彩,陈 磊

(海南医学院第二附属医院 麻醉科，海南 海口，570311)

丙泊酚是常用麻醉药之一，但会引起一些不良反应[1]。麻醉剂与患者手术后认知障碍(POCD)密切相关。研究[2-3]表明，丙泊酚可通过磷酸化海马区Tau蛋白诱导POCD的发生。目前，丙泊酚导致认知功能障碍的机制尚不清楚，有学者[4]认为海马神经元γ-氨基丁酸A(GABA)受体与认知功能关系密切。本研究观察丙泊酚麻醉对老龄大鼠认知功能和海马GABA受体的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取50只清洁级Wista大鼠，鼠龄20～22月龄，体质量360～420 g,雌雄不限，由长沙市天勤生物技术有限公司生产提供，许可证号为SCXK(湘)2014-0011,使用许可证号为SYXK(湘)2014-006。动物处理及实验过程得到海南医学院动物关怀及使用委员会的许可(IACUC0023)。实验研究过程中严格遵守3R原则。

1.2 主要仪器及试剂

呼吸麻醉机(武汉医用仪表有限公司)，呼吸监护仪(Datex Engstorm仪器公司，芬兰)。商用体温传感器(Philips公司，德国)，啮齿动物脉搏血氧计和心率监测仪(Datex Engstorm仪器公司，芬兰)。

RPMI-1640培养液、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，兔抗鼠GABA单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体(Sigma公司，美国);丙泊酚(批号090822,河北九派制药有限公司);酶标仪SpectraMax M5P[上海美谷分子仪器(上海)有限公司]，倒置相差显微镜(上海苍茂实业有限公司)，低温高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司),SDS-PAGE凝胶电泳及转移装置(上海优宁维生物科技股份有限公司),LAS400凝胶成像系统(GE公司，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理:所有实验动物在动物房进行适应性饲养1周。50只大鼠随机分为丙泊酚组与对照组，每组25只。丙泊酚组大鼠腹腔注射1%丙泊酚中/长链脂肪乳注射液6 mL/kg,对照组腹腔注射等体积的生理盐水。所有注射药物密封信封内，操作人员随机分配。将大鼠放入麻醉箱，置于37 ℃环境中连接麻醉机，以混有30%氧气的空氧混合气体作为载体气体，通气流速(mL/min)=0.65×体质量(g)。

1.3.2 生命体征记录:记录每只大鼠直肠温度、心率、呼吸频率和血氧饱和度(SpO2)。采用商用体温传感器测定大鼠直肠温度。使用啮齿动物脉搏血氧计和心率监测仪评估心率和SpO2。通过计数大鼠的胸部运动的次数来记录呼吸速率。麻醉开始后，大鼠被放置在恒温毯上以保持各项参数的稳定。

1.3.3 认知功能检测:实验完毕后选取15只大鼠，清醒后继续饲养48 h,实施Morris水迷宫实验。迷宫按照顺时针分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ部分。水池和平台黑色，平台放置于第Ⅱ部分。池水染成黑色，温度保持在26 ℃,开启设备。软件自动记录大鼠活动行迹，逃逸潜伏期定义为下水至找到平台的时间，游泳路程定义为总里程，实验进行5 d。实验结束后的第2天移除平台，大鼠从Ⅰ部分下水，记录大鼠120 s内穿越平台区域次数和时间。

1.3.4 苏木精-伊红染色(HE)及尼式染色:实验完毕后，解剖出脑海马组织，制备石蜡切片(10 μm),脱蜡、脱水，尼氏染色液染色，蒸馏水洗涤，脱水。光学显微镜下观察神经细胞形态及尼氏体。

1.3.5 Western Blot检测GABA蛋白量表达:实验完毕后1 d选取6只大鼠，解剖出脑海马组织，加入2 mL RIPA组织裂解液，匀浆，冰浴30 min,40 ℃下500×g离心5 min,吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10 μL待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭1 h,逐次兔抗鼠GABA单克隆抗体、HRP标记的二抗。Bio-Rad成像仪曝光成像,Image Lab Software测定光密度，结果以目标蛋白与参照蛋白条带比值表示相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 2组生命体征比较

2组麻醉开始时肛温、心率、呼吸频率、SPO2比较，差异无统计学意义(P>0.05)。麻醉后,2组大鼠肛温、心率、呼吸频率、SPO2均呈现一定程度的下降，而后逐渐恢复平稳，但2组各时间点上述指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

A:SPO2变化;B:呼吸频率变化;C:肛温变化;D:心率变化。

2.2 丙泊酚对大鼠水迷宫实验逃逸潜伏期的影响

随着实验时间的延长,2组大鼠逃逸潜伏期、总里程数逐渐减小，丙泊酚组大鼠各时间点逃逸潜伏期、总里程均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 2组大鼠不同时间点逃逸潜伏期比较 s

表2 2组大鼠不同时间点总里程比较 m

2.3 丙泊酚对大鼠穿越平台区域次数和时间的影响

丙泊酚组大鼠穿越平台区域次数、时间分别为(3.09±0.42)次、(17.15±1.36) s,对照组大鼠穿越平台区域次数、时间分别为(8.36±1.03)次、(39.02±4.73) s,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 2组大鼠海马CAI区HE染色及尼式染色

对照组海马区Nissl体存在于细胞浆及树突，染色较深，神经细胞排列整齐，形态规则;丙泊酚组Nissl体消失，神经细胞数量减少，细胞核破裂、丢失。见图2。

A:丙泊酚组大部分Nissl体在神经细胞中消失(箭头1),神经细胞核丢失(箭头2);B:对照组神经细胞胞浆内的Nissl体。

2.5 丙泊酚对大鼠海马GABA蛋白的影响

丙泊酚组大鼠海马GABA蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

3 讨 论

丙泊酚属于临床常用的静脉麻醉剂，具有起效快、苏醒时间短、副作用小等优势[5]。丙泊酚可以抑制海马CAI区细胞突触的长时程增强，引发POCD[6]。本实验对大鼠进行了腹腔注射丙泊酚，观察大鼠的认知功能，结果表明，丙泊酚组大鼠各时间点逃逸潜伏期、总里程均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);随着实验时间的延长,2组大鼠逃逸潜伏期、总里程数逐渐减小，丙泊酚组大鼠穿越平台区域次数、时间低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),表明丙泊酚对大鼠认知功能具有一定的干扰。

研究[7-8]认为，丙泊酚可激活GABA，抑制神经细胞的信号传导，导致认知功能障碍，出现顺行性和逆行性遗忘等表现。GABA是海马区中重要的抑制性神经递质，研究[9-10]发现，阿尔兹海默病、帕金森综合征等疾病海马区域存在GABA低表达或GABA能受损。研究[11]发现，海马区域中的GABA受体与认知功能有潜在的联系。研究[12]表明，老年痴呆患者及轻度认知障碍患者GABA水平明显降低。本研究观察丙泊酚麻醉后大鼠海马区域GABA受体蛋白的表达，结果表明，丙泊酚组大鼠海马GABA蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),提示GABA受体与丙泊酚诱导的认知功能障碍有一定的联系。

Nissl体正常存在于神经元胞体和树突中，参与蛋白质合成。神经元胞体内Nissl体大量存在表明神经元合成蛋白质的功能较强;反之，神经元功能存在障碍时,Nissl体减少或消失。研究[13]表明，人记忆功能与海马部分蛋白质分泌、突触间信号传递相关。本研究结果显示，丙泊酚组大鼠海马区神经元、Nissl体受损，考虑丙泊酚导致的认知障碍可能与Nissl体功能障碍相关。

综上所述，丙泊酚麻醉对大鼠认知功能具有一定的影响，可能与海马区GABA受体的表达有关，其具体机制仍待进一步研究证实。