eNOS-894G/T基因多态性与佳木斯地区原发性高血压的相关性研究

赵海峰，郑欣欣，隋小芳，王凤玲，华玥祺，沈士焜

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154002；2.佳木斯大学研究生部；3.佳木斯大学附属第一医院 健康管理体检中心；4.佳木斯大学附属第一医院 老年病科)

原发性高血压(EH)在中国的发病率呈逐年递增趋势[1-2]。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第七外显子G894T发生基因突变可使其合成的eNOS结构发生改变，影响其功能，导致一氧化氮(NO)合成减低[3]，进而影响血压[4]。但该基因突变与EH相关性在不同人群中结果存在争议[5]。因此本研究通过对佳木斯地区老年人群进行eNOS-894G/T基因多态性与EH的相关性研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2015年12月至2016 年 4 月期间在佳木斯大学附属第一医院就诊及体检中心体检的人群为研究对象，选取符合入组标准的受试者共214名，其中EH组114人，包括男性61人、女性53人，平均年龄65.71±10.47岁；健康对照组100人，包括男性52人、女性48人，平均年龄65.60±8.42岁。两组人群均签署了知情同意书。

纳入及排除标准：EH组入组人群均满足《中国高血压基层管理指南(2014年修订版)》的诊断标准，或既往诊断为EH的患者，经药物治疗血压控制在正常范围者亦纳入本组；健康对照组人群满足体检及化验无异常，无心脑血管疾病等慢性病病史。排除继发性高血压及合并其他系统并发症者。

1.2 信息采集及DNA制备

对纳入的对象进行性别、年龄、既往史及家族史等一般资料的询问，记录标准化测量的血压及各项生化指标。另收集5 ml静脉血储存于-20℃冰箱。待所有血样集齐后，统一使用柱状法提取100 μl DNA溶液于-20℃冰箱保存。运用Nanodrop ND-1000分光光度计得到其浓度及纯度后，进一步稀释DNA溶液，测量出DNA浓度a，并与蒸馏水配成50 μl溶液，所需DNA溶液量计算方式为：50-1000/a，4 ℃保存备用。

1.3 SNPs的基因分型

1.3.1引物设计 通过NCBI数据库查询eNOS 894G/T SNP所在的DNA序列，并使用Premier5.0和Oligo6.0设计引物，上游引物：5’-TTCGACGTGCTGCCCCT-3’；下游引物：5’-GGGCAGAAGGAAGAGTTCT GG-3’，由北京擎科生物有限公司进行引物合成。

1.3.2PCR反应 PCR扩增选用10 μl体系，按要求配置后石蜡油封闭。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；三步循环：95℃变性20 s，51℃复性20 s，72℃延伸5 s，45个循环；然后再72℃延伸30 s，95℃变性30 s，25℃复性2 min，94℃变性30 s，24℃复性4 min。

1.3.3PCR产物的HRM分析 Light Scanner仪专用96孔板中的PCR产物通过2 000 rpm离心5 min后放入仪器中进行数据采集，使用Light ScannerCall IT软件进行数据分析，本人群中eNOS-G894T多态性被分为GG、GT两种基因型。

1.4 统计学处理

利用统计学软件SPSS 20.0进行数据处理。两组人群基因型和等位基因频率运用直接计数法进行计算，使用哈迪温伯格平衡(HWE)检验验证样本的群体代表性，P>0.05为符合HWE。计数资料均采用例(%)表示，组间比较采用t检验，不同基因型间比较采用χ2检验。数据有统计学意义需满足P<0.05。

2 结果

2.1 各组研究对象的一般情况

两组研究对象的年龄和性别构成无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 各实验组研究对象年龄和性别构成的比较

2.2 eNOS-894G/T基因多态性的哈迪温伯格平衡分析

使用HWE检验公式对eNOS-894G/T基因多态性在对照组及EH组人群分布情况进行校验，发现SNP位点分布符合HWE(P>0.05)，表示研究人群可以代表所在群体，见表2。

表2 eNOS-894G/T基因多态性的哈迪温伯格平衡分析

2.3 两组的eNOS-894G/T基因型和等位基因频率分布

对照组及EH组的GG基因型频率为83%(83例)、70.2%(80例)，GT基因型频率为17%(17例)、29.8%(34例)，eNOS-G984T基因型频率在两组中的分布存在差异，且有统计学意义(P=0.028)。对照组及EH组G等位基因频率分别为91.5%(183例)、85.1%(194例)，T等位基因频率分别为8.5%(17例)、14.9%(34例)，eNOS-G984T等位基因频率在两组中的分布存在差异，且有统计学意义(P=0.041)，见表3。

表3 两组的eNOS-894G/T基因型和等位基因频率分布

3 讨论

eNOS 基因由26个外显子和25个内含子组成，定位于染色体7q35-q36区[6]。Hingorani等首次发现eNOS基因第七外显子上894位鸟嘌呤到胸腺嘧啶的突变(G894T),导致其289位天冬氨酸取代谷氨酸，eNOS螺旋结构发生改变，从而影响eNOS的活性无法正常催化NO的合成及血压调节[7-9]。故该基因突变与EH存在一定关联性。但目前国内外对于eNOS-894G/T多态性与高血压发病率的研究存在争议。Lacolley等在高加索人群研究中观察到eNOS 894G/T位点T等位基因携带者EH患病率较G等位基因携带者高，未发现等位基因与血压水平及脉搏波传导速度相关性，故不能明确该位点突变参与血压调节[10]。而在日本的一项研究通过注入胆碱后记录前臂血管流动速度来评估血管舒张功能，结果证实eNOS-894G/T多态性影响内皮依赖的血管舒张功能，但差异未达到统计学意义，且高血压组及健康对照组中等位基因及基因型分布无差异性[11]。在一项中国荟萃分析中同样发现第七外显子第894位T等位基因突变与北方人群高血压发生存在关联，而南方人群中无显著性差异[12]。

本研究采用病例-对照的方法来评价eNOS-894G/T多态性与高血压的关系，结果发现，其基因型和等位基因频率在两组中的分布存在差异，具有统计学意义(P<0.05),证实了eNOS-894G/T突变T等位基因是高血压危险因素，而刘永生等学者在老年人群的研究中也有相同的结论[13]。但由于基因多态性存在种族差异、不同基因位点变异存在关联性、研究方法不同以及样本入组差异等都可能作为混杂因素干扰实验结果，因此精准可靠的实验结果仍需在今后大样本标准化调查研究中或荟萃分析中验证。