TGM2在肺癌中的表达及诊断意义
2021-03-25王晶莹刘启迪
王晶莹,刘 洋,刘启迪
(1.吉林大学中日联谊医院 a.检验科;b.呼吸内科,吉林 长春130033；2.吉林大学第二临床医院 放射线科)
人组织谷氨酰胺转胺酶(TGM2)是一种具有转谷氨酰胺酶交联(TGase)、G蛋白信号转导和激酶活性的多功能酶，被认为在多种疾病中起作用。TGM2的mRNA通过选择性剪接进行调控，产生C端截短形式的TGM2，被预测具有独特的生化特性和生物学功能。本研究将生物信息学手段联合临床分析，基于Western blot方法及免疫组化法验证并观察蛋白TGM2在肺癌中的表达及诊断意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象
收集就诊于吉林大学中日联谊医院同时临床确诊为肺癌患者的肿瘤组织及癌旁组织(男性22例，女性28例)，取少量新鲜组织标本，快速、低温条件下，PBS洗涤组织标本，以手术消毒剪刀将组织分为较小块状，置于冻存管中。液氮保存，备用。
1.2 方法
1.2.1蛋白提取 取组织，在液氮中研磨，加入组织蛋白裂解液，低温震荡，冰敷，此步骤重复三次。低温超速离心机离心(Tempreture:4℃,speed:12 000 rpm/min,time:1 h),将上清取少量用于蛋白浓度测定，其余大部分上清转移至新的EP管中，-80℃保存，备用。
1.2.2Western blot 微量加样器取经预处理的蛋白样品，注入凝胶内，电压110 V。将凝胶电泳分离的蛋白进行切割，留取目的蛋白所在凝胶片段，置于已经完成活化的膜上，电流 90 mA，1 h，5%脱脂奶粉封闭。稀释TGM2抗体，4℃，孵育过夜。PBS-吐温洗膜。脱脂奶粉稀释二抗，室温孵育2 h；洗膜。化学发光法曝光。
1.2.3生物信息数据库分析 登录TCGA数据库，检索肺癌组织中差异表达的基因，并根据表达的差异水平，对差异基因进行筛选。
1.2.4免疫组化 将肺癌的病理切片进行脱蜡，再经酶灭活、抗原修复、冷却、PBS冲洗等一系列的预处理，将稀释的一抗滴加至组织切片上，低温孵育过夜；常温孵育二抗，4小时。显色，复染，分化，返蓝，封片。
1.2.5统计学分析 采用SPSS 13.0分析，组间差异采用卡方检验，P<0.05具有统计学差异。
2 结果
2.1 TCGA数据库检索
TGM2在肺癌中的基因表达水平，通过检索TCGA数据库，结果如图1所示，肺癌组织中的TGM2基因显著低于癌旁组织。
图1 差异表达基因TGM2在TCGA数据库检索结果
2.2 Western blot分析TGM2的表达水平
Western blot分析肺癌组织及癌旁组织中蛋白TGM2的表达，结果如图2所示，发现TGM2在肺癌组织中的表达显著低于癌旁组织。
图2 TGM2在肺癌及癌旁组织中的表达
2.3 TGM2的表达与临床分析
免疫组化实验中，对组织切片进行染色，结果如图3。经统计分析，如表1，发现TGM2蛋白在肺癌组织中有更显著的低表达，具有统计学差异(P<0.05)。
图3 TGM2在肺癌及癌旁正常组织中的表达(×200)
表1 肺癌与癌旁组织中TGM2蛋白表达情况对比
3 讨论
TGM2是谷氨酰胺转胺酶家族中最复杂和最普遍的成员，它通过引入高度稳定的ε-(γ-谷氨酰胺基)赖氨酸异肽键或在Ca2+存在下在选定的肽结合谷氨酰胺残基上结合多胺来催化蛋白质的翻译后修饰[1]。此外，TGM2还可以水解核苷酸三磷酸鸟嘌呤(GTP)，并作为蛋白质二硫键异构酶、激酶[1-2]。在生理学上，TGM2被认为是细胞或组织防御机制的一个组成部分；它的表达经常被上调，以应对细胞损伤或其他应激源，以保护细胞免受内源性和环境压力的影响，并在以后修复组织以实现持续的体内平衡。
最近的一些研究认为TGM2在多种癌症中的表达异常[3-7]。重要的是，TGM2表达的增加通常与耐药性有关[4-7]。对区域特异性DNA甲基化的详细分析表明，TGM2是参与的基因之一，其表达水平因耐药癌细胞的甲基化的状态而改变[8]。在后来的一项研究中，科研人员[9]观察到TGM2基因是耐药癌细胞表观遗传沉默的一个有希望的靶点，其甲基化状态可以作为化疗敏感性肿瘤的标记物。同样，TGM2在肿瘤标本中的表达与患者的转移扩散和不良的疾病预后相关[5,7]。利用功能丧失和获得的方法，一些研究者报告了TGM2的异常表达促进了对化疗药物的抵抗和癌细胞的侵袭性[4-9]。TGM2也与表皮生长因子受体介导的肿瘤发生有关[10]。核转录因子-κB(NF-κB)、缺氧诱导因子(HIF)-1α、Akt和黏着斑激酶(FAK)的激活以及肿瘤抑制因子PTEN(第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力素同源物)的下调是TGM2表达的常见反应途径。最近，TGM2在丝氨酸216处的磷酸化被认为是诱导NF-κB和Akt激活和PTEN下调的关键[11]。本研究通过对TGM2在肺癌中的表达水平的研究，认为TGM2可作为肺癌潜在的肿瘤标志物。
