荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用

张汇征，李 桓，张 珍，李俊刚，王 静，廖传玉，周 刚，陈耀凯，严晓峰，罗 明*

(重庆市公共卫生医疗救治中心 1.中心实验室；2.感染科；3.药剂科；4.结核科，重庆400036)

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的慢性传染病。中国是30个结核高负担国家之一，同时也是耐多药结核(MDR-TB)高负担国家之一。2010年第五次中国结核病流行病学抽样调查的结果显示,中国现有活动性肺结核患者总数为523万，其中传染性肺结核患者总数为134万。特别值得注意的是，此次调查显示中国肺结核患者耐多药率为6.8%，情况十分严重[1]。WHO估算2016年中国结核病患病人数约为78万人，其中MDR-TB患者约5.8万人[2]。

结核分枝杆菌及其耐药性的快速检测是结核病临床诊断一直以来的热点和难点。传统的检测如涂片镜检，其灵敏度较低；细菌的培养(包括固体培养和液体培养)，需要数周时间；而药敏实验不仅耗时长，更需要在生物安全实验室中进行相关操作，在一般的区县结防机构和医院中难以推广，难以满足临床的需要[3]。因此，近年来，分子诊断技术因其快速及高灵敏度，被更多的应用于结核的检测[4]。

重庆市公共卫生医疗救治中心自2016年7月采用荧光PCR熔解曲线法对病人利福平和异烟肼的耐药性进行检测。本研究将通过对临床数据的回顾性分析，评估荧光PCR熔解曲线法在结核病临床诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取重庆市公共卫生医疗救治中心2016年7月至2018月7月进行过荧光PCR熔解曲线法结核检测的患者1 048例，其中男性630例，女性418例，年龄8-83岁。样品包含痰液，脑脊液，脓液，纤支镜灌洗液，胸水和穿刺液。

1.2 主要试剂与仪器

CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；MGIT960结核菌快速培养仪(BD)；thermo scientific高速冷冻离心机；Genexpert全自动荧光定量PCR工作站及MTB/RIF检测试剂盒(Cephid)；利福平耐药检测试剂盒和异烟肼耐药检测试剂盒，Lab-Aid 820 结核分枝杆菌核酸提取试剂盒和Lab-Aid 824 核酸提取仪购自厦门致善生物。

1.3 方法

1.3.1分离培养 样品培养前处理按照《分枝杆菌分离培养标准化操作及质量保证手册》[5]中关于碱处理-中和离心沉淀法的要求进行，并按照BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养操作说明书将前处理后的沉淀物接种于MGIT960培养管。

1.3.2结核菌的药敏试验 改良罗氏比例法参照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》的要求操作[6]；Genexpert按Cephid公司操作指南进行；荧光PCR熔解曲线法参照试剂盒配套说明书进行，所有样品用Lab-Aid 820 结核分枝杆菌核酸提取试剂盒和Lab-Aid 824 核酸提取仪处理，提取基因组DNA；取5 μl核酸加入含20 μl PCR反应液的PCR管中，放入CFX96实时荧光定量PCR仪进行扩增和熔解曲线分析。PCR程序如下：UNG处理50℃ 2 min，1个循环；预变性95℃ 10 min，1个循环；Touchdown循环95℃ 15 s，70℃ 20 s(每个循环下降1℃)，13个循环；PCR循环76℃ 25 s，95℃ 15 s，57℃ 20 s，76℃ 25 s，42个循环。熔解分析：95℃ 2 min，40℃ 2 min，45℃-85 ℃(设置在此阶段每1 ℃采集FAM和TET通道荧光信号)，1个循环。当样品的熔解温度(Tm)与阳性对照的Tm一致(误差不超过1℃)时判定为野生型；样本的Tm低于阳性对照2℃或2℃以上时判定为突变型。当利福平或异烟肼任一抗生素检测体系有两个通道以上有有效信号时，判定检测到结核分枝杆菌。金标准为分枝杆菌培养或Genexpert任一检验TB阳性判定该标本为TB阳性。

1.3.3统计学方法 用Microsoft Excel软件进行基础数据整理，采用SPSS 13．0分析软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌检测结果

1 048例标本中，MGIT960培养和Genexpert共检测到619例TB阳性，429例阴性。阳性标本中，培养法检测到314例，Genexpert检测到574例，熔解曲线法检测到318例。三种方法的敏感度分别为MGIT960 50.73%，Genexpert 92.73%，PCR熔解曲线法51.37%。PCR熔解曲线法的特异度为93.24%(400/429)。

2.2 结核分枝杆菌药敏检测结果

共有185例标本同时完成了表型药敏检测和PCR熔解曲线法检测。PCR熔解曲线法检测利福平药敏的灵敏度为93.2%，特异度为80.2%，符合率为84.3%；检测异烟肼药敏的灵敏度为92.6%，特异度为86.3%，符合率为88.6%。见表1。

表1 PCR熔解曲线法与比例法检测RIF和INH药敏结果比较

3 讨论

结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，也是制定结核病治疗方案的重要依据。长期以来，结核病的实验室诊断主要还是依靠涂片镜检和细菌培养，存在灵敏度低(涂片镜检)和操作复杂，耗时长(结核细菌培养)等缺点，而获得结核药敏需时更长[4]。利福平和异烟肼是治疗结核病的主要一线药物，同时耐这两种药物的结核称为耐多药结核(MDR-TB)。MDR-TB治疗难度大、治愈率低、病死率高，发现不及时会导致新的耐药产生和MDR-TB的传播[2,7]。目前发现基因突变是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制，如利福平的耐药主要由rpoB基因突变引起，异烟肼的耐药相关基因有inhA，katG和ahpC等[8]。

荧光PCR熔解曲线是近年来应用于结核检测的一种分子检测方法，具有准确，快速，操作简单等优点，被用于检测对利福平，异烟肼，喹诺酮类，乙胺丁醇以及吡嗪酰胺等药物耐药的结核病[9-13]。但是目前的研究主要是用分离培养获得的菌株作为检测样品，直接以临床标本作为检测样品的研究还较少[10,14-16]。

本研究选取2016年7月至2018年7月在重庆市公共卫生医疗救治中心检验科进行荧光PCR熔解曲线结核检测的1 048例病例，将其检测结果分别与培养和Genexpert的结果比较其对结核检测的灵敏度。结果显示，荧光PCR熔解曲线法的检测灵敏度(51.37%)与MGIT960液体培养(50.73%)相近，但低于Genexpert(93.24%)。其原因可能是，第一，荧光PCR熔解曲线法和Genexpert虽然都是基于荧光PCR的检测方法，但是Genexpert一个检测用的样品量较大(1 ml)，而荧光PCR熔解曲线法的上样量小(5 μl DNA)；第二，荧光PCR熔解曲线法样品需处理提取核酸，难免会导致样品量的损失，因此降低了其灵敏度。

与传统药敏比较，PCR熔解曲线法检测利福平和异烟肼耐药的灵敏度高(>90%)，特异度和符合率较高(>80%)，与之前对痰液的研究结果一致[17]，说明PCR熔解曲线法不仅可以用来检测痰液也可以用来检测其他临床样品。

总之，通过本研究，荧光PCR熔解曲线法可以直接对临床样本快速检测结核菌及其耐药性，具有有效、可靠、灵敏度高的特点，能够及时对临床制定治疗方案提供依据。