黄河鲤肾脏的显微和亚显微结构观察

樊明明，宋予震，吴玉臣，吕玉金，张 丽，聂 丹，刘忠虎

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2.河南农业大学，河南 郑州 450046)

脊椎动物的肾脏是机体维持体液平衡的主要器官，鱼类是水生低等脊椎动物，其肾脏起源于中胚层的生肾节，在发育过程中经历头肾和中肾两个阶段，并各自具备相应的输导管，即前肾管和中肾管[1]。鱼类的肾脏不仅是主要的泌尿器官，还是主要的免疫造血器官，尤其是头肾，在功能上相当于高等脊椎动物的脊髓[2]。目前，一些学者分别对Pleuronectesplatessa[3]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[4]、鳜鱼(Sinipercachuatsi)[5]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[6-7]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[8]以及黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[9]的头肾进行了研究，从组织学、细胞学等方面阐述了头肾的主要结构和功能。Ellis等[10-14]分别对多种鱼类的中肾进行了组织和功能的研究，通过这些研究对比发现，肾脏在不同的鱼类中存在些许差异，其发育过程可能具有一定的进化意义。但是截至目前，关于鲤鱼肾脏的系统研究资料还较少，已知关海红[12]对鲤鱼(Cyprinuscarpio)的肾脏进行了观察，其研究发现，在重金属作用下，鲤鱼肾脏会发生肾小球萎缩及局部肾组织坏死，但并未指明头肾与中肾的差别。因此笔者以黄河鲤(C.carpiohaematopterus)为研究对象，对其头肾和中肾结构分别进行显微和亚显微水平上的观察，以期为黄河鲤组织学和免疫学研究方面提供参考资料，进而完善硬骨鱼类的相关研究资料，同时也为鱼类的进化研究提供可参考的基础性材料。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

试验用健康黄河鲤，购自郑州市水产市场，充氧运回实验室，置于水温20 ℃的养殖箱中充气暂养7 d后用于试验操作。

1.2 组织切片制作

用MS-222麻醉并解剖鱼体取出头肾和中肾，浸入波恩氏液4 ℃固定24 h后用自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度6 μm，经苏木精—伊红(H·E)和过碘酸—雪夫(PAS)染色，中性树胶封片后置于光学显微镜(Motic)下观察并拍照(Motic Images Plus 2.0)。

1.3 透射电镜样品制作

取头肾和中肾组织，修块后浸入2%多聚甲醛与2.5%戊二醛混合固定液(0.1 mol/L 磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)，4 ℃固定过夜，0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液 4 ℃下冲洗3 h，1%锇酸4 ℃固定1 h，双蒸水冲洗，经梯度丙酮脱水后，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染，JEOL JEM-1230透射电镜观察并照相。

2 结 果

2.1 肾脏的解剖学结构

鲤鱼头肾(前肾)位于心腹腔隔膜的前背方，新鲜时颜色呈褐红色，无被膜，由左右对称形似长椭圆形的两叶构成，直径约0.5 cm，头肾与中肾之间有条索样组织相连，为中肾组织的延伸，边缘不整齐，与背大动脉平行贴附。中肾也称体肾，是鱼类成体的排泄器官，呈块状组织，紧贴体腔背壁，腹面覆有腹膜，中肾分左右两叶，左侧为近似四边形，右侧为近似三角形；宽约1.3 cm。沿中肾向下依然有条索状中肾组织延伸，同时左、右侧中肾各连一条输尿管；输尿管眼观为白色细管状结构，向尾部延伸，最终汇聚入泄殖腔(图1a)。

2.2 肾脏的显微和亚显微结构

2.2.1 头肾

光学显微镜下：头肾中无肾单位，未见明显小梁，有大量的血管分布，其他部分主要为拟淋巴组织。头肾中的细胞主要有：淋巴细胞(占大部分)、粒细胞、红细胞、成团或散在分布的黑色素巨噬细胞以及甲状腺滤泡(图1b)。

电子显微镜下：头肾中细胞类型较为丰富，淋巴细胞和红细胞数量最多，其次电镜下可见血管内皮细胞、嗜酸性粒细胞以及小杆细胞，也有一些未知的细胞类型存在(图1c)。此外，还可见未知细胞中的低电子密度颗粒(图1d)及巨噬细胞内的线粒体(图1e)。

2.2.2 中肾

光学显微镜下，中肾由肾单位、拟淋巴组织、结缔组织、血管组成。肾单位包括肾小管和肾小体。

肾小体又称马氏小体，外被肾小囊又称鲍曼氏囊。马氏小体壁薄，壁层由单层扁平上皮构成，此上皮组织延伸包围该小球，在肾小体尿极处与肾小管颈段相连，此外其血管极与球外毛细血管相通，分为出球微动脉和入球微动脉，两者的管内皮均为单层扁平上皮，但出球微动脉的管腔较入球微动脉粗。脏层由足细胞构成，足细胞呈星形多突状，胞体较大，包在每条毛细血管的外面，过碘酸—雪夫染色时毛细血管壁呈阳性(图2)。

肾小管是由肾小体尿极延伸出的管状结构，由于其上皮细胞高度、管腔大小、以及刷状缘有无的不同，可以将肾小管分为以下几段：

颈段：该段较短，管腔较窄，壁为单层矮立方上皮细胞，界限清晰，细胞核为圆形且占的比例较大，着色深，管腔游离面刷状缘发达，管壁上皮细胞高约(10.3±1.3) μm，腔径约(9.5±1.7) μm，刷状缘高(2.4±0.9) μm(图2a)。过碘酸—雪夫染色时，胞质不着色，核呈深蓝色，刷状缘呈强阳性(图2b)。

第一近端小管：该段长且弯曲，管腔的平均直径较颈段大，壁为单层柱状上皮，细胞排列紧密，界限不清晰，游离面具有发达的刷状缘，柱状细胞高度约(23.4±3.6) μm，腔径约(16.8±2.3) μm，刷状缘高度约(4.1±1.3) μm，有的第一近端小管上皮细胞之间，往往夹杂有大量染色较深的淋巴细胞(图2c)。过碘酸—雪夫染色时胞质着色较浅，刷状缘呈强阳性(图2d)。

第二近端小管：上皮细胞为单层高柱状，细胞核呈椭圆形，位于细胞端位，胞质着色较浅，细胞界限不清晰。柱状细胞高度约(17.3±2.1) μm，管腔直径约(22.3±1.9) μm，刷状缘高度约(2.6±0.8) μm。上皮细胞高度下降，刷状缘的发达程度也不及第一近端小管(图2e)，其重吸收功能有所减弱。过碘酸—雪夫染色时胞质着色浅，刷状缘阳性程度较第一近端小管低(图2f)。

图2 中肾肾小管、集合管、输尿管及中肾内的其他结构Fig.2 Renal tubules，collection tube,ureter and other structures in mesonephrosa～b.颈段，黑色箭头示刷状缘；c～d.第一近曲小管，黑色箭头示刷状缘；e～f.第二近曲小管，黑色箭头示刷状缘；g～h.间段，黑色箭头示管腔无刷状缘；i～j.远端小管，黑色箭头示不规则刷状缘；k～l.集合管，黑色箭头示管外基膜；m.集合管；n.输尿管；o～p.甲状腺滤泡；q～r.黑色素巨噬细胞；s～t.肾小体，黑色实心箭头示肾小囊腔，黑色空心箭头示肾小囊壁层，白色空心箭头示肾小囊脏层，白色实心箭头示出球微动脉，空心三角形示入球微动脉；图a、c、e、g、i、k、o、q、s为苏木精—伊红染色；图b、d、f、h、j、l、p、r、t为过碘酸—雪夫染色；NS.颈段；PⅠ.第一近曲小管；PⅡ.第二近曲小管；IS.间段；D.近端小管；CT.集合管；G.肾小体；MM.黑色素巨噬细胞.a—b.neck segment,brush border (black arrow);c—d.the first proximal convoluted tubule,brush border (black arrow);e—f.the second proximal convoluted tubules,brush border (black arrow);g—h.intermediate segment,no brush border in it (black arrow);i—j.the distal tubule,irregular brush border(black arrow);k—l.the collection tube,basement-membrane (black arrow);m.collection tube;n.ureter;o—p.thyroid follicular;q—r.melanin macrophages,;s—t.renal corpuscle,capsular space (black solid arrow),the parietal layer of renal capsule (black hollow arrow),the visceral layer of renal capsule (white hollow arrow),efferent arteriole (white solid arrow),hollow triangle shows afferent arteriole;figures a,c,e,g,i,k,o,q,and s are stained by H·E;figures b,d,f,h,j,l,p,r,and t are stained by PAS;NS.neck segment;PⅠ.the first proximal convoluted tubule;PⅡ.the second proximal convoluted tubule;IS.intermediate segment;D.proximal tubule;CT.collection tube;G.renal corpuscle;MM.melanin macrophage.

间段：与颈段相似，细胞呈立方状，高度(10.1±1.5) μm，细胞核圆形，但较颈段细胞核着色浅，细胞质着色不均匀，呈放射线状，上皮细胞间会夹杂淋巴细胞，是连接近端与远端小管的过渡部分，管腔较窄，腔径(4.1±0.8) μm，无刷状缘(图2g)，过碘酸—雪夫染色时无明显阳性部位(图2h)。

远端小管：管径明显较第一、二近端小管小，细胞为单层矮柱状(近立方)，高度(15.1±2.1) μm，细胞界限清晰，核为圆形，有不规则刷状缘，高度(2.0±1.2) μm，有的上皮之间也存在游走淋巴细胞(图2i)，过碘酸—雪夫染色时刷状缘呈弱阳性(图2j)。

集合管：是由肾小管汇集形成，有单个存在(图2l)，也有集中区域(图2k，m)，其管径大小不一，介于10～40 μm间，上皮外有明显的基膜层，且上皮间游离淋巴细胞明显增多，随着不断延伸，管外基膜逐渐增厚，最后汇集进入输尿管。

输尿管：上皮为复层上皮，管腔内有大量黏液，管外有较厚的黏膜肌层，厚约40 μm，主要由环肌构成(图2n)。

甲状腺滤泡：苏木精—伊红染色时，嗜酸性强，呈粉红色均质状，过碘酸—雪夫染色时呈强阳性(图2p)直径大小不一，小至2～3 μm，大至20～30 μm，呈椭圆形或不规则形分布。甲状腺滤泡上皮为单层扁平细胞(图2o)。

黑色素巨噬细胞：为圆形或椭圆形，直径1～3 μm不等，苏木精—伊红染色时呈褐黄色，团状或散在分布于肾组织间(图2q)，过碘酸—雪夫染色时呈阳性(图2r)。

电子显微镜下，除了肾单位之外，中肾中最常见的细胞类型为淋巴细胞和血细胞，也可见内皮细胞、小杆细胞、嗜酸性粒细胞以及未知的细胞类型(图3a)；肾小管上皮细胞胞质内可见内质网和线粒体及其清晰的核(图3b)。肾小球滤过膜主要包括3部分，肾小囊脏层、基膜、毛细血管内皮。肾小囊脏层主要由足细胞组成，外形不规则，胞体围绕毛细血管内皮细胞，足细胞胞体伸出形成初级突起，初级突起又形成次级突起，即为足突，紧贴在毛细血管基膜上。小突起之间有许多孔隙——裂孔。毛细血管为有孔型，附着在基膜上(图3c)。

图3 中肾超微结构Fig.3 The ultrastructure of mesonephrosa.中肾，白色五角星示淋巴细胞，白色空心箭头示血管内皮细胞，黑色实心箭头示肾小管上皮细胞，黑色空心箭头示未知细胞；b.肾小管上皮细胞，黑色箭头示胞质内的线粒体和内质网；c.肾小球滤过膜，白色实心箭头示血管内皮细胞，黑色空心箭头示足细胞，白色空心箭头示足细胞初级突起，大黑色实心箭头示次级突起，小黑色实心箭头示血管球基膜;E.嗜酸性粒细胞;N.细胞核;RBC.红细胞;RC.小杆细胞;R.小杆.a.mesonephros,lymphocytes (white pentagram),vascular endothelial cells (white hollow arrow),the epithelial cells of renal tubular (black solid arrow),and unknown cells (black hollow arrow);b.the epithelial cells of renal tubular,mitochondria and endoplasmic reticulum (black arrow);c.glomerular filtration membrane,vascular endothelial cell (white solid arrow),podocyte (black hollow arrow),primary processes (white hollow arrow),secondary processes (large black solid arrow),glomerular basement membrane (small black solid arrow);E.eosinophils;N.nucleus;RBC.red blood cell;RC.rodlet cell;R.rodlet.

3 讨 论

3.1 黄河鲤肾脏组织结构和功能与其他硬骨鱼类的比较

根据外部形态，硬骨鱼类肾脏大致可分为5种类型[2]，黄河鲤肾脏类型属于其中1种：头肾较为明显，但已无肾单位，组织基本上为淋巴样组织，细胞类型较为丰富，可见有散在的黑色素巨噬细胞和甲状腺滤泡。

头肾是鱼类胚胎时期的主要泌尿器官，随着个体发育逐渐失去泌尿机能，成为具有造血功能的免疫器官[1,15-16]。本试验结果发现，黄河鲤的头肾内没有肾单位，主要由拟淋巴组织、血窦及一些散在的粒细胞、黑色素巨噬细胞、甲状腺滤泡和内含较多超低电子密度物质的未知细胞构成。目前除了有学者在成体弹涂鱼(Periopthalmuscantonensis)头肾内发现肾单位之外，其他已报道的硬骨鱼类头肾中均未见肾单位[6,11,17]，没有肾单位充分说明黄河鲤的头肾已经完全失去泌尿功能。莫桑比克罗非鱼[4]的头肾有门状区、淋巴管、被膜下窦和淋巴滤泡等，其与哺乳动物的淋巴结相似，而黄颡鱼[9]和西藏墨头鱼(Garrakempi)[18]的头肾内未发现甲状腺滤泡，这种差异是否与鱼类的生理状态或生活环境相关还有待进一步研究确认，但是大量的拟淋巴组织和血窦的存在，学者们均认为头肾是硬骨鱼的兼具造血功能的免疫器官。

黄河鲤的中肾有完整的肾单位，但有些海水鱼如海马、海龙等的肾单位缺肾小球，相比较，淡水鱼比海水鱼有更大和更多的肾小球。黄河鲤的肾小管由肾小体的尿极开始依次分为颈段、第一近端小管、第二近端小管、间段、远端小管、集合管，最后汇集进入输尿管，与其他硬骨鱼类相比，不仅分段存在差异，各段的管腔大小以及管壁上皮细胞高度，刷状缘的有无和高度均存在一定的差异，这也是目前争议较多的地方，如食蚊鱼(Gambusiaaffinis)[11]无颈段但是有间段，贝氏高原鳅(Triplophysableekeri)[13]和西藏墨头鱼[18]均无颈段和间段。Sakai[19]认为硬骨鱼类均缺少颈段和间段，而林浩然[20]则认为鱼类均有颈段和间段，根据笔者的观察结果，黄河鲤的肾小管有颈段和间段。这说明黄河鲤的中肾是其主要的泌尿器官。同时在中肾中还观察到了小杆细胞，该细胞仅存在于硬骨鱼类中，是一种具有潜在免疫功能的细胞[21-23]，这说明中肾不仅具有泌尿功能，还具有一定的免疫功能。

3.2 不同组织结构与进化地位

头肾和中肾的肾实质中，除了存在血管结缔组织外，还存在有拟淋巴组织，主要包括血窦、淋巴细胞、红细胞、粒细胞、小杆细胞以及黑色素巨噬细胞和甲状腺滤泡，拟淋巴组织的多少反映了鱼类的进化水平[24-26]，黄河鲤肾脏内大部分为拟淋巴组织，同时还存在一些甲状腺滤泡和黑色素巨噬细胞，说明其在硬骨鱼类的进化中处于中等地位[27-28]。此外在黄河鲤中肾内偶见多个集合管聚集在一起由基膜包裹的现象，在西藏墨头鱼中肾中未见此现象，在斑鳜(S.scherzeri)[27]肾组织中则有较多集合管聚集存在的现象，因此推测黄河鲤的进化地位处于中等地位[18]。

4 结 论

黄河鲤头肾已退化为具有造血功能的免疫器官，中肾为主要的泌尿器官，且在头肾和中肾组织中均存在一种硬骨鱼类特有的具有潜在免疫功能的小杆细胞，进一步说明了黄河鲤肾脏具有一定的免疫功能，根据其结构特征综合推测黄河鲤在硬骨鱼的进化中处于中等地位，但鱼类的进化和演变过程较为复杂，具体的进化地位研究需要更多资料支撑以确定。