氮营养盐对极北海带幼苗生长和生理生化特性的影响

袁艳敏，刘福利,2，梁洲瑞,2，王 潇,3

(1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业资源可持续利用重点开放试验室，青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术国家试验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能试验室，青岛 266000；3.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

近年来，海水富营养化和重金属污染问题日益严重，对海水养殖业和人类健康造成极大威胁。海藻是海洋生态系统的初级生产者，利用海藻的吸收、富集和降解作用可以去除污水中的营养物质、重金属和有机毒物，具有显著的生态环境改善效果[1]。极北海带(Laminariahyperborea)耐低光能力极强，其光补偿点可低至4.6 μmol/(m2·s)[2]，适于在较深的水域生长。当前我国正在积极推进海洋牧场建设，海藻场是决定海洋牧场效益的关键组成因素。由于我国近海海水透明度普遍较低，投放的人工鱼礁水层较深，因光照限制很难增殖起规模化的“海藻森林”，而极北海带拥有“个体大、多年生、耐低光”三大特征，可作为我国构建海藻场的优良藻种。

氮、磷营养盐在大型海藻生长和发育过程中扮演着重要角色。研究发现，水体中缺乏氮、磷营养盐时可严重影响海带(Saccharinajaponica)配子体的形成时间和雌雄分化，在添加氮、磷营养盐的人工海水中胚孢子大部分能正常形成配子体，且氮、磷的配比对海带的发育也有一定影响[3]。孙菊燕[4]研究发现，在过高和过低氮、磷剂量下细基江蓠(Gracilariatenuistipitata)藻体内藻红素、叶绿素a、蛋白质含量降低，生长速率明显减慢。硝态氮质量浓度的增加可使龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)藻体的色素和可溶性蛋白含量及营养盐吸收速率均显著提高，即在海水富营养化条件下，龙须菜的生长、生化成分和营养盐的吸收都会受到影响[5]。

海藻的分布、生长、发育和繁殖等生命过程均会受到温度、光照、营养盐等环境因子的影响，尤其是海藻幼苗对各种环境因子变化相对敏感，探究幼苗生长发育的最适环境条件，对开展海藻的栽培意义重大。极北海带幼苗在早期对环境条件(温度、光照、营养盐)的需求和响应的研究较少，目前尚未见硝态氮对极北海带幼苗生长、生理生化影响的报道。笔者以配子体克隆培育的极北海带幼苗为试验对象，通过分析氮营养盐的不同水平对极北海带生长和生化特性的影响，研究适宜幼苗生长的最优营养盐条件，以期为极北海带苗种生产、人工养殖及海藻场建设提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用极北海带配子体来源于法国布列塔尼半岛海区，其幼苗通过配子体克隆技术培育约2个月获得。幼苗培养条件为：温度13 ℃，光合有效辐射为40～50 μmol/(m2·s)，光周期12L∶12D，天然海水经过滤、高压灭菌冷却后添加营养盐(PO43--P：0.4 mg/L，NO3--N：4 mg/L)作为培养液。

1.2 试验方法

选取藻体长度为3～5 cm、无褶皱损伤、无病害的健康幼苗作为试验材料。NO3--N质量浓度梯度为0、0.5、2、4、6、8、10 mg/L，PO43--P：0.4 mg/L。其他培养条件：温度9 ℃，光合有效辐射40 μmol/(m2·s)，光周期12L∶12D。每个处理组至少3个平行。

1.2.1 不同氮营养盐质量浓度下极北海带幼苗相对生长速率的测定

挑选健康的极北海带幼苗，称量藻体鲜质量，各氮营养盐质量浓度处理组平均体长为(3.0±0.1)～(5.0±0.1) cm、平均鲜质量为(1.0±0.05) g。每隔3 d换水一次，10 d后称量鲜质量，相对生长速率(RRG)按下式计算：

RRG=[ln (mt/m0)/t]×100%

式中，m0为初始藻体的鲜质量(g)，mt为试验结束时藻体的鲜质量(g)，t为试验持续的时间(d)。

1.2.2 生化指标的测定

极北海带藻体鲜质量测定结束后，立刻用液氮将不同处理组的极北海带幼苗速冻并储存在超低温冰箱中。本试验测定的生化指标包括：色素(叶绿素a和类胡萝卜素)、可溶性蛋白质、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、丙二醛、超氧阴离子。

根据文献[6-7]中的方法，测定叶绿素a和类胡萝卜素的含量，其他指标的测定均采用酶联免疫吸附分析法。酶联免疫分析检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行各个指标的测定。超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性单位以U/mg表示[8]。

1.3 数据处理

采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析、Duncan多重比较及Pearson相关性分析(P<0.05为差异显著)，用Excel软件绘制图形。

2 结 果

2.1 不同氮质量浓度下极北海带幼苗的相对生长速率

氮营养盐水平对极北海带相对生长速率有显著影响(图1)。2～8 mg/L是极北海带生长的适宜氮质量浓度，相对生长速率显著高于其他氮质量浓度，分别为8.50%/d～9.48%/d，该质量浓度范围内的相对生长速率无显著差异。氮质量浓度为0.5、10 mg/L时，极北海带相对生长速率分别为5.87%/d、4.75%/d，显著低于最适宜质量浓度，但显著高于氮质量浓度0 mg/L(相对生长速率为3.54%/d)，说明过高或过低的氮质量浓度均会限制极北海带的相对生长速率。试验周期内，在不同氮质量浓度下极北海带藻体颜色和形态无显著变化。

图1 不同氮质量浓度下处理10 d后极北海带幼苗的相对生长速率Fig.1 The relative growth rates of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration for 10 days柱状图上的不同字母表示在0.05水平具有显著性差异(P<0.05)，下同.The means different letters on the histogram are significant difference at the level of 0.05 (P<0.05),et sequentia.

2.2 不同氮质量浓度下极北海带幼苗的丙二醛和超氧阴离子含量

方差分析结果表明，氮质量浓度的变化对极北海带幼苗的丙二醛含量有显著影响。培养液中氮质量浓度为0和0.5 mg/L时，极北海带幼苗丙二醛含量较高，显著高于氮质量浓度2～10 mg/L。氮质量浓度为8 mg/L时，丙二醛含量最低，其他各组间均无显著差异(图2)。Pearson相关性分析表明，丙二醛含量与相对生长速率呈显著负相关(P<0.05)。

图2 极北海带幼苗在不同氮质量浓度下的丙二醛含量Fig.2 MDA content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations

氮质量浓度变化对极北海带幼苗的超氧阴离子含量有显著影响。氮质量浓度在4～10 mg/L时，超氧阴离子含量无显著性差异且含量较低，而在低氮质量浓度(0～0.5 mg/L)下，超氧阴离子含量显著升高(图3)。Pearson相关性分析表明，超氧阴离子含量与丙二醛含量呈极显著正相关(P<0.01)，说明超氧阴离子的积累，引起细胞膜脂质过氧化，进而导致丙二醛含量上升。

图3 极北海带幼苗在不同氮质量浓度下的超氧阴离子含量Fig.3 Superoxide anion content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration

2.3 不同氮质量浓度下极北海带幼苗的可溶性蛋白含量

极北海带幼苗可溶性蛋白含量随着氮质量浓度的增加呈升高趋势。可溶性蛋白含量最高值位于氮质量浓度为6、8 mg/L时，分别为14.63、14.57 mg/g，均高于氮质量浓度为4、10 mg/L时的含量，但无显著性差异。0～2 mg/L氮质量浓度组的可溶性蛋白含量显著低于氮质量浓度为4～10 mg/L组，且可溶性蛋白含量随着氮质量浓度的增加显著升高(图4)。Pearson相关性分析表明，可溶性蛋白含量与相对生长速率呈极显著正相关(P<0.01)。

图4 极北海带幼苗在不同氮质量浓度下的可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration

2.4 不同氮质量浓度下极北海带幼苗的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶)活性

氮质量浓度变化对极北海带幼苗超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性均有显著影响，即适宜的氮质量浓度下活性低，高氮或低氮质量浓度下活性高。氮质量浓度为6 mg/L时极北海带幼苗超氧化物歧化酶活性最低，显著低于氮质量浓度0、0.5、8、10 mg/L，与氮质量浓度为2、4 mg/L时无显著差异。氮质量浓度为10 mg/L时超氧化物歧化酶活性显著高于0.5、2、4 mg/L。氮质量浓度为6 mg/L时极北海带幼苗的过氧化物酶活性最低，显著低于氮质量浓度0、0.5、10 mg/L。氮质量浓度为0 mg/L时过氧化物酶活性最高，显著高于其他各组。氮质量浓度为10 mg/L时过氧化物酶活性显著高于0.5 mg/L，其他各组间过氧化物酶活性无显著性差异。极北海带幼苗的过氧化氢酶活性在氮质量浓度为2、4、6、8 mg/L时均较低，其中，氮质量浓度为4、6、8 mg/L时极北海带幼苗过氧化氢酶活性显著低于氮质量浓度0、0.5、10 mg/L。氮质量浓度为2 mg/L时显著低于10 mg/L，其他各组间无显著性差异(图5)。Pearson相关性分析表明，过氧化物酶与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶均呈显著性正相关(P<0.05)，说明三者对氮质量浓度的变化具有相似的响应趋势。

图5 极北海带幼苗在不同氮质量浓度下的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性Fig.5 Specific activities of SOD,POD and CAT of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations柱状图上的字母下标为相同数字的作为同一组，进行多重比较，同一组的不同字母表示在P<0.05水平具有显著性差异，下同.The letters with the same number subscript on the histogram indicate the same group,and the different letters in the same group show significant difference at the level of P<0.05,et sequentia.

2.5 不同氮质量浓度下极北海带幼苗的色素(叶绿素a和类胡萝卜素)含量

氮质量浓度对极北海带幼苗叶绿素a和类胡萝卜素含量有显著的影响。极北海带幼苗叶绿素a的含量随氮质量浓度的增加呈现先升后降的趋势，氮质量浓度为4、6 mg/L时极北海带叶绿素a含量无显著性差异，均显著高于其他质量浓度组。氮质量浓度为10 mg/L时极北海带叶绿素a含量最低，显著低于2～8 mg/L质量浓度组，其他各组间无显著性差异。极北海带幼苗类胡萝卜素含量在氮质量浓度为4 mg/L时最高，显著高于0、10 mg/L组，极北海带幼苗类胡萝卜素含量在氮质量浓度10 mg/L时最低，显著低于除对照外的其他氮质量浓度组，其他各组间无显著性差异(图6)。

图6 极北海带幼苗在不同氮质量浓度下的叶绿素a和类胡萝卜素含量Fig.6 Chlorophyll-a and carotenoid contents of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations

3 讨 论

极北海带自然分布于大西洋东北部沿岸，其分布、生长、发育及繁殖等生命过程受到温度、光照度、营养盐含量等环境因子的影响，尤其是幼苗阶段对各种环境因子变化相对敏感[9]。笔者主要讨论氮营养盐含量对极北海带幼苗生长和生化成分的影响，为探究极北海带的苗种繁育、人工养殖和对富营养化水域的调控能力提供参考。

3.1 氮营养盐质量浓度对极北海带幼苗生长的影响

氮、磷营养盐在大型海藻的生长发育过程中具有重要的作用，研究发现，氮是藻类光合器官的重要组成成分，是藻体生长的营养基础，氮营养盐的增加能够为以氮为基本元素的各种蛋白和化合物的合成提供原料，氮的加富必然促进藻体内氮代谢反应，从而导致氮同化物的积累，在氮充足的条件下，酶类、氨基酸、叶绿素、藻胆蛋白可大量合成而作为藻体的氮库[10-13]。硝态氮增加可促进龙须菜的生长速率，提高色素和可溶性蛋白含量[7]。水体营养水平较高时，龙须菜色素、蛋白质及总氮含量均较高，且生长速度快[14]。海水总无机氮含量过低、氮磷比过高以及氨氮在总无机氮中所占比例较低等条件下，均可导致芋根江蓠(G.blodgettii)藻体营养不良、生长缓慢[15]。海带幼孢子体生长的适宜氮营养盐质量浓度为4～8 mg/L[16]。在本试验中，氮质量浓度4～6 mg/L时极北海带幼苗的叶绿素a含量显著高于其他各质量浓度，氮质量浓度2～8 mg/L时幼苗的相对生长速率均较高，氮质量浓度4～8 mg/L时可溶性蛋白含量显著高于其他质量浓度组且与相对生长速率呈极显著正相关，因此，可以推断极北海带生长最适宜的氮质量浓度为2～8 mg/L，这与Kain[9]报道的欧洲沿岸野生极北海带适宜氮含量以及我国养殖海带适宜的氮含量范围基本相同。

3.2 氮营养盐质量浓度对极北海带幼苗生化成分的影响

植物体内可溶性蛋白质大多是酶类，参与细胞的各种代谢活动，其含量是反映植物体总代谢的一个重要指标[17]。超氧阴离子是活性氧的一种，植物体内活性氧的积累会导致氧化胁迫，对细胞的伤害之一是启动膜脂过氧化连锁反应，使维持细胞区域化的膜系统受损或瓦解[18]。膜脂过氧化即非脂性自由基如超氧阴离子对类脂中不饱和脂肪酸引起的一系列自由基反应，一般被认为是活性氧对细胞膜系统伤害的原初机理，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一，常被作为判断膜脂过氧化的一种主要指标[18]。弱光、高光胁迫下极北海带幼苗体内超氧阴离子和丙二醛含量均高于适宜光照时的含量[19]。黄鹤忠等[20]发现，细基江蓠繁枝变型(G.tenuistipitatavar.liui)在低硝态氮和高硝态氮的营养盐水平下丙二醛含量显著高于中等硝态氮含量组，表明过高或过低的硝态氮含量均会对江蓠的生理生长产生不利影响。本试验中，在低氮营养盐质量浓度0、0.5 mg/L时极北海带幼苗的超氧阴离子和丙二醛含量均高于其他质量浓度组且与丙二醛含量呈极显著正相关，丙二醛含量与相对生长速率呈显著负相关。因此，低营养盐含量时极北海带可能处于非最佳生理状态，导致体内超氧阴离子积累，使细胞处于氧化胁迫状态，膜脂过氧化对细胞膜造成了一定的伤害，进而导致极北海带的相对生长速率降低。

活性氧对细胞膜系统的损伤不可修复，植物体的抗氧化系统使活性氧含量处于不断产生和清除的动态平衡中。植物本身的抗氧化系统主要包括酶促抗氧化系统(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等)和非酶促抗氧化系统(抗坏血酸与类胡萝卜素以及一些含巯基的低分子化合物等)，遭受环境胁迫时，活性氧代谢平衡被破坏，酶促和非酶促抗氧化系统共同作用，清除积累的活性氧，减少对细胞的损害[21-22]。试验表明，不同氮、磷质量浓度对海藻的超氧化物歧化酶和过氧化物酶等抗氧化酶活性、膜脂过氧化产物等均产生显著影响。龙须菜藻体的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性随氮磷质量浓度的降低而逐渐升高，高氮质量浓度下长时间培养时酶活性降低，抗氧化系统作用降低，藻体可能会面临死亡[23]。在最适宜的营养盐条件下，芋根江蓠在生化组分(光合色素及可溶性蛋白)和抗氧化能力等方面都表现较好，过低或过高质量浓度的无机氮均使得丙二醛、过氧化物酶活性升高，影响藻体生长[15]。逐渐增加水体中硝态氮含量，细基江蓠繁枝变型的硝酸还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性均显著呈现先增后降的趋势，且与丙二醛呈相反的趋势[20]。本试验中，在低氮质量浓度(0～0.5 mg/L)时，极北海带幼苗的超氧阴离子水平明显升高，此时超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性均升高，尤其是过氧化物酶活性，与氮质量浓度为0 mg/L时相比升高较明显，表明这3种抗氧化酶尤其是过氧化物酶在清除藻体内自由基时起着关键作用。而在低氮处理组中，丙二醛有较明显的积累，表明在低氮营养盐水平下抗氧化酶的作用可能受到限制。在高氮环境(10 mg/L)时，极北海带幼苗的超氧阴离子并未表现出较高的水平，同时丙二醛也无明显的积累，这可能与3种抗氧化酶活性在高氮环境时均明显升高有关。由此推测，幼苗虽然均处于非最佳生理状态，但高氮环境和低氮环境对极北海带幼苗的抗氧化酶系统的影响并不相同。

3.3 氮营养盐质量浓度对极北海带幼苗色素含量的影响

类胡萝卜素是非抗氧化系统重要的组成部分，在所有的单线态氧猝灭系统中，类胡萝卜素具有最重要的生物学意义。类胡萝卜素存在于叶绿体内，一方面阻止激发态叶绿素分子的激发从反应中心向外传递；另一方面，它也保护叶绿素分子免遭光氧化损伤[24]。本试验胁迫条件为高氮和低氮剂量时，类胡萝卜素含量均无显著升高，表明其对氮胁迫无显著响应。幼苗的叶绿素a含量在4～6 mg/L时显著高于其他各剂量组，因此极北海带生长最适宜的氮质量浓度为4～6 mg/L。在非最适的氮环境(高氮和低氮)时，幼苗叶绿素a含量降低，对藻体的光合作用产生影响，从而使幼苗生长速率降低。