福尔马林药浴防治红鳍东方鲀异沟虫病的研究

2021-03-25吴禹濛姜洁明叶仕根

水产科学 2021年2期

袁震，刘鹰,3，吴禹濛，姜洁明，张磊，刘奇，叶仕根

(1.大连海洋大学，辽宁大连 116023；2.设施渔业教育部重点实验室，辽宁大连 116023；3.青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东青岛 266205)

红鳍东方鲀(Takifugurubripes)俗称河鲀，主要分布于太平洋西北部[1]，是中国、日本和韩国重要的海水养殖鱼类[2]，因其味道鲜美、肉质鲜嫩，素有“鱼中之王”的美称，深受消费者喜爱，有较高的经济价值。近年来，红鳍东方鲀的养殖产量逐渐增大，2017年红鳍东方鲀养殖总产量达24 403 t[3]。但由于养殖密度过高、水环境质量较差等原因，红鳍东方鲀病害问题屡屡发生[4-5]。异沟虫(Heterobothriumtetrodonis)是养殖红鳍东方鲀最常见的寄生虫性病原之一[6]。

异沟虫，属钩铗虫目、八铗虫科、异钩盘虫属，为红鳍东方鲀和暗纹东方鲀 (T.obscurus) 等鲀科鱼类所特有的寄生虫，虫体成舌状，背腹扁平，体长5～20 mm[7]，后部有4对对称排列的固着铗。异沟虫主要寄生于红鳍东方鲀的鳃部，患病鱼表现为体色发黑，食欲减退，游动迟缓或伏底不动[8]。该病病程较长，发病率可达90%以上，死亡率超过75%，且一年四季均可发病。

福尔马林是养殖水体消毒和水产动物疾病治疗的常用药物[9-11]。在韩国，质量浓度为100～300 mg/L的福尔马林常用于控制陆基水族箱和网箱养殖的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、许氏平鲉(Sebastesschlegeli)等体表寄生虫的防治[12]。与其他消毒、杀虫类药物相比，福尔马林安全耐受剂量范围较广、毒性低、残留少，成本相对低廉[13]。然而福尔马林在水中可残留一段时间[14]，同时福尔马林会降低水中的溶解氧水平，易导致缺氧情况发生[15]。因此，在尚未有安全、有效的药物之前，研究福尔马林对异沟虫的杀灭效果及其安全性，形成安全、有效的防治方案，对红鳍东方鲀异沟虫病的防治具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病红鳍东方鲀幼鱼(200日龄，150尾)，平均体质量约为(20±5) g，取自大连某红鳍东方鲀养殖企业。自150尾中随机取10尾病鱼检查发现，其全部鳃的带虫数分别为47、53、41、41、48、39、58、54、49、44个。经皮肤、黏液等组织镜检后未发现患有其他寄生虫病，红鳍东方鲀活体暂养于大连海洋大学水产设施养殖与装备工程技术研究中心。养殖水槽容积为1 m3，日换水2次，每次换水达90%，养殖水温17～19 ℃，盐度32，氨氮≤0.01 mg/L，亚硝态氮≤0.005 mg/L。24 h不间断充气，溶解氧≥5 mg/L。每日早、中、晚各饱食投喂颗粒饲料1次。

福尔马林溶液(分析纯，甲醛含量37.0%～40.0%)购自辽宁泉瑞试剂有限公司。

尼康显微镜(E600POL)用于异沟虫以及虫卵孵化过程的观察与拍照。

1.2 异沟虫虫卵孵化观察

自患有异沟虫病的红鳍东方鲀幼鱼的鳃上取出虫卵，放入500 mL烧杯中，微充气孵化，水温17～19 ℃，每日换水1次。每隔6 h观察1次虫卵，确定其孵化状态。

1.3 福尔马林对异沟虫的杀灭效果

为了比较福尔马林对不同发育阶段异沟虫的杀灭效果，根据虫体大小将异沟虫分为幼虫(体长≤1 cm)和成虫(体长>1 cm)两组，分别进行试验。

首先，将15尾患病红鳍东方鲀幼鱼随机放入5个水槽(10 L)中，每个水槽暂养3尾，水槽中福尔马林溶液的剂量分别设置为500、550、600、650、700 mL/m3，浸浴0.5 h后，取鱼两侧所有鳃组织，分别于显微镜下观察；同时，将另外15尾病鱼也随机放入5个水槽中，每个水槽3尾，福尔马林浸浴剂量与上述设置相同，即500、550、600、650、700 mL/m3，1 h后取鱼两侧所有鳃组织镜检。若虫体在30 s无内蠕动现象发生即判定寄生虫死亡。在每个试验组中，分别计算异沟虫总数(红鳍东方鲀鳃部所有异沟虫幼虫和成虫的总和)，药浴后幼虫存活数、药浴后成虫存活数、药浴后异沟虫幼虫存活率，以平均值±标准差表示。幼虫存活率为幼虫存活数占幼虫总数的百分比。

1.4 福尔马林药浴安全性评价

为了评价福尔马林药浴的安全性，将45尾病鱼随机放入15个水槽中，每3个水槽为1个平行，分别加入福尔马林溶液(剂量设置与1.3相同)，浸浴12 h。每隔0.5 h观察并记录鱼体状态，连续观察12 h。统计各试验组鱼体出现如呼吸困难、游动缓慢甚至无力游动等异常状态的时间及最终死亡率。

1.5 数据处理

所得数据用SPSS 11.0和Microsoft Excel 2016软件分析处理，采用单因素方差分析显著性，P<0.05认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 异沟虫虫卵孵化过程

经观察，在17～19 ℃下，异沟虫虫卵5.5 d孵化出幼虫，8 d孵化结束，虫卵孵化大致可分为4个阶段。孵化初期(卵孵化开始后0～36 h)：虫卵通体发黑，不透明，无法看清内部结构(图1a)；孵化中期(卵孵化开始后36～84 h)：虫卵颜色变淡，透明度增加，卵两端变空，卵内胞质向中间聚集(图1b)；孵化后期(卵孵化开始后84～132 h)：虫卵颜色继续变淡，呈黄绿色，卵内胞质继续向中心聚集，已能初步观察到幼虫的形态(图1c)；破卵(卵孵化开始后132～192 h)：幼虫钻出虫卵，进入水体中寻找宿主(图1d)。整个异沟虫虫卵孵化过程约持续8 d。同一批次中，剩余未孵化成功的卵，若再继续观察3 d后仍未孵化，可判定该卵孵化失败。对红鳍东方鲀鳃部异沟虫卵镜检统计发现，其总体孵化率约为50%，并未观察到明显的孵化高峰期。

图1 异沟虫虫卵孵化过程Fig.1 The incubation of H.tetrodonis eggs a.孵化初期；b.孵化中期；c.孵化后期；d.破卵.a.initial stage of incubation;b.middle stage of incubation;c.late stage of incubation;d.hatching.

2.2 福尔马林对异沟虫的杀灭效果

试验发现，在试验剂量范围内，福尔马林药浴对体长≤1 cm的异沟虫杀灭效果较好，但不能有效杀灭体长>1 cm的异沟虫。在福尔马林药浴0.5 h的试验组中发现，500、550 mL/m3剂量不能彻底杀灭异沟虫幼虫。红鳍东方鲀鳃丝中异沟虫幼虫存活率分别为34.74%和11.90%，当福尔马林剂量≥ 600 mL/m3，福尔马林对异沟虫幼虫的杀灭效果良好，异沟虫幼虫存活率不足5%。在福尔马林药浴1 h的试验组中，剂量为500、550 mL/m3的福尔马林溶液对异沟虫幼虫的杀灭效果要好于药浴0.5 h(P<0.05)，但仍有部分幼虫存活。当福尔马林剂量≥600 mL/m3时，所有异沟虫幼虫均被杀灭(表1)。

表1 福尔马林药浴后异沟虫的存活情况Tab.1 The survival of H.tetrodonis in the formalin bath

2.3 福尔马林药浴对红鳍东方鲀安全性的初步评价

在福尔马林剂量为500、550 mL/m3试验组中，分别有2尾鱼于7.5 h时出现异常，试验结束时(12 h)分别有6尾鱼死亡，死亡率为66.6%；在剂量为600 mL/m3的试验组中，1尾鱼于药浴后5 h时出现异常，最终9尾鱼全部死亡，死亡率为100%；在剂量为650 mL/m3的试验组中，2尾鱼药浴后4 h出现异常，最终9尾鱼全部死亡，死亡率为100%；在剂量为700 mL/m3的试验组中，4尾鱼药浴后3 h出现异常，最终9尾鱼全部死亡，死亡率为100%(表2)。

表2 福尔马林药浴红鳍东方鲀安全性评价Tab.2 Safety evaluation of tiger puffer T.rubripes treated by formalin

3 讨论

3.1 福尔马林药浴防治红鳍东方鲀异沟虫病的有效性

《水产动物病害学》[7]中对于异沟虫病的防治方法分别为实施淡水浸泡和双硫二氯酚拌料投喂，其中淡水浸泡效果较差，而双硫二氯酚作为剧毒药物，对养殖鱼类的毒性极大，并会产生药物残留，误食后会对人体造成严重损伤，国家已禁止其用于养殖鱼类。福尔马林溶液是水产养殖常用药物之一，常被用于水产养殖动物的体表寄生虫的防治中。Shinn等[16]研究表明，合理控制水体中的福尔马林含量，可有效预防多子小瓜虫(Ichyhyophthiriusmultifiliis)病的暴发。闫茂仓等[17]研究表明，使用20～80 mg/L的福尔马林溶液药浴可有效防治刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)病。在水产养殖中，与鲁哥氏液、高锰酸钾相比，福尔马林对多子扇形游仆虫(Euplotesvannus)和寡毛双眉虫(Diophrysoligothrix)的杀灭效果更好[18-19]。此外，福尔马林也被用于防治鱼体外部感染所致疾病，如水霉(Saprolegnia)病、微杯虫病、车轮虫病、斜管虫病等[20-22]。

本试验结果表明，福尔马林对红鳍东方鲀异沟虫幼虫有较好的杀灭效果，600～700 mL/m3浸浴1 h可以杀灭绝大多数异沟虫幼虫，但对体长超过1 cm的成虫没有明显效果。这可能是因为成虫抵抗力较强，已经很难在保证鱼体安全的情况下通过药浴的方式将其杀灭。因此，不建议使用福尔马林杀灭异沟虫成虫。异沟虫成虫防治方法还需进一步研究。前期试验发现，异沟虫虫卵由卵丝互相连接成串状，通常有数个虫体的卵互相缠绕在一起，拖拉在宿主鳃孔的外面，在鱼游泳时这些卵串会被挂在养鱼的网箱上或海藻上并进行孵化。孵化后的幼虫会在水中寻找宿主，遇到合适的宿主后就随着鱼呼吸时的水流附着到鳃组织及皮肤上[7]。故研究虫卵离体孵化时间在红鳍东方鲀异沟虫病实际防治过程中十分必要。本试验结果显示，离体状态下，异沟虫虫卵经5.5～8 d可孵化出幼虫，所以在红鳍东方鲀异沟虫病防治期间应阶段性持续用药，避免出现幼虫再次寄生的情况。

3.2 福尔马林药浴防治红鳍东方鲀异沟虫病的安全性

研究表明，福尔马林代谢快速度快，生物累积低，在合理控制施用剂量和时间的情况下，对鱼体毒性相对较小[23]。研究发现，大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)幼鱼每日使用质量浓度为167 mg/L的福尔马林溶液药浴1 h，连续处理20 d后，鱼的各项生长和生理的指标均无显著变化[24]；斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)幼鱼经质量浓度为25 mg/L的福尔马林溶液浸泡4 h，每周连续浸泡4 d，共计处理28周后进行解剖，结果发现，试验组鱼的鳃部相比于对照组无明显损伤[25]。福尔马林浸泡不会影响大西洋鲑(Salmosalar)幼鱼的生长速度，与对照组相比，鱼的血清电解质、血细胞和存活率均无明显变化[26]。综上所述，使用适量的福尔马林浸泡，可以有效防治因外部感染所致疾病，且对鱼体损伤较小，适用于防治红鳍东方鲀异沟虫病，故通过试验手段确定福尔马林溶液的安全用量对于红鳍东方鲀养殖显得尤为重要。本试验显示，在水温为17～19 ℃，500～550 mL/m3福尔马林浸泡下，20 g的幼鱼在7.5 h之后会出现中毒反应；在600～700 mL/m3福尔马林浸泡时，4～5 h之后试验鱼会出现中毒反应。娄忠玉等[27]利用福尔马林药浴银鲑(O.kisutch)苗种时发现，当其他条件不变时，水温升高，福尔马林毒性增大。因此，红鳍东方鲀幼鱼养殖环境的其他因素(如pH、溶解氧等)对防治效果的影响还有待进一步探究。同时应注意，用药后切忌在福尔马林休药期内将鱼上市，以免药物残留危害消费者的健康。